Denna metod skapar en konkret, välbekant miljö för musen för att navigera och utforska under mikroskopiska avbildning eller encelliga elektrofysiologiska inspelningar, som kräver fast fixering av djurets huvud.
Det är allmänt erkänt att användning av narkosmedel kan undergräva betydelsen av elektrofysiologiska eller mikroskopiska data från en levande djurets hjärna. Dessutom begränsar den långa återhämtning från anestesi frekvens av upprepade inspelning / imaging episoder i longitudinella studier. Därför är nya metoder som skulle möjliggöra stabila inspelningar från icke-sövda beter möss förväntas avancera områdena cell-och kognitiv neurovetenskap. Befintliga lösningar sträcker sig från rent fysiskt tvång till mer sofistikerade metoder, såsom linjära och sfäriska löpband som används i kombination med datorgenererade virtuella verkligheten. Här är en ny metod som beskrivs där ett huvud-fast musen kan flytta runt en luft-lyfte mobil homecage och utforska sin omgivning under stressfria förhållanden. Denna metod gör det möjligt för forskare att utföra beteendetester (t.ex. lärande, tillvänjning eller nya objekt erkännande) samtidigt medtvå-foton-mikroskopisk avbildning och / eller patch-clamp inspelningar, alla kombinerade i ett enda experiment. Denna video-artikeln beskriver användningen av den vakna djur huvud fixeringsanordning (mobil homecage), demonstrerar procedurerna från djur vanebildning, och exemplifierar ett antal möjliga tillämpningar av förfarandet.
En spännande trend i neurovetenskap är att utveckla experimentella metoder för molekylär och cellulär sondering av neuronala nätverk i hjärnan av vaken, beter gnagare. Sådana metoder håller lovar att kasta nytt ljus på neurofysiologiska processer som ligger bakom motorik, sensorimotor integration, perception, inlärning, minne, samt skade progression, neurodegeneration och genetiska sjukdomar. Dessutom inspelning från vaken djurets hjärna håller löftet i utvecklingen av nya läkemedel och behandlingar.
Det finns en växande medvetenhet om att anestesi, vilket har varit vanligt förekommande i neurofysiologiska experiment, kan påverka de grundläggande mekanismerna för hjärnans funktion, vilket kan leda till felaktig tolkning av experimentella fynd. Därmed ökar ofta används bedövningsmedlet ketamin snabbt bildande av nya Dendritutskotten och ökar synapserna 1; en annan vanlig anesthetic isofluran vid kirurgisk anestesi nivåer undertrycker helt spontan kortikal aktivitet i nyfödda råttor och blockerar spindel-burst svängningar hos vuxna djur 2. För närvarande endast ett begränsat antal metoder möjliggör experiment i icke-sövda möss med hjälp av två-photon mikroskopisk avbildning eller patch-clamp inspelningar. Dessa metoder kan uppdelas i fritt rörliga och huvud-fasta beredningar.
Den unika attraktionskraft ett fritt rörliga djur preparatet är att det tillåter bedömning av naturligt beteende, inklusive hela kroppsrörelser under navigering. Ett sätt att bilden inne i hjärnan av en fritt rörliga gnagare är att fästa en miniatyriserad huvudmonterade mikroskop eller fiberskop 3-5. Men miniatyriserade enheter tenderar att ha begränsad optisk prestanda jämfört med mål-baserad två-photon mikroskopi, och kan inte vara lätt kombineras med hela cell patch-clamp inspelningar 6.
Den existing lösningar för huvud-fastställande av en vaken gnagare har förlitat sig huvudsakligen antingen fysiskt tvång 7,8 eller på utbildning djuret uppvisa frivillig nackskyddet 9. En annan populär metod är att låta djurets ben att röra sig genom att placera det på, till exempel, en sfärisk löpband 10; detta tillvägagångssätt är ofta kombinerat med datorgenererad virtuell verklighet. Elektrofysiologiska experiment på huvudet fixerade möss har mestadels använt cellulära inspelningar och användes för att studera centrala regleringen av kardiovaskulär funktion 11, effekter av anestesi på nervaktivitet 12, den auditiva svar i hjärnstammen 13 och informationsbehandling 14. De banbrytande intracellulära / hel-cell inspelningar i vakna beter djur har utförts under 2000-talet och har fokuserat på neural aktivitet relaterad till perception och rörelse 15-20. Ungefär samtidigt, var de första mikroskopiska avbildningsstudier på vakna möss pubställts, där två-foton-mikroskopi användes i den sensoriska cortex av fysiskt fastspända råttor 7 och på möss som kör på en sfärisk löpband 21.
Efterföljande in vivo mikroskopi och elektrofysiologiska studier har visat att ett huvud fixering preparatet kan framgångsrikt kombineras med beteendeparadigm som baseras på forelimb rörelser, lukt erkännande, vispning, och slicka 8,22-25. Möss som ställs på den sfäriska löpband kan tränas att navigera den virtuella visuell miljö som genereras av en dator 10,26. Intracellulära / cellulära inspelningar visade att, i en huvud-fast djur navigerar sådan virtuell miljö, aktivering av hippocampus plats celler kan detekteras 27. I en virtuell visuell miljö, möss visar normal rörlighet relaterade theta rytm i det lokala området potential och theta-fas precession under aktiv rörelse 27. Nyligen, den rumsliga och tidsmässiga Verksamhety mönster av neuronala populationer registrerades optiskt i möss under arbetsminnet beslutsuppgifter i en virtuell miljö 28.
Trots att ha aktiverat banbrytande forskning, har den sfäriska löpband designen flera inneboende begränsningar. För det första djuret som krävs för att gå på en obegränsad yta av en roterande luft lyfte bollen, vilket inte medför några påtagliga hinder som väggar eller barriärer. Denna begränsning är endast delvis kompenseras av den datorgenererade "virtual reality", eftersom visuell ingång är utan tvekan mindre effektiv på möss och råttor i jämförelse med den taktila sensorisk insignal (t ex, whisker-touch eller slicka), som dessa arter förlitar naturligt vidare. För det andra kan en betydande krökning av kulans yta vara obekvämt för laboratoriemöss som används för att gå på ett plant golv i sina burar. Slutligen blotta diametern för kulan (åtminstone 200 mm för möss och 300 mm för råttor) gör den vertikala storleken för den sfäriskalöpband anordningen relativt stor. Detta gör det svårt att kombinera sfärisk löpband med de flesta kommersiellt tillgängliga mikroskopi uppställningar, och kräver ofta att bygga en ny inställning runt löpbandet med hjälp av skräddarsydda mikroskop ramar.
Här är en ny metod som beskrivs där ett huvud-fast musen kan flytta runt en luft-lyfte mobil homecage som har en platt golv och konkreta väggar, och utforska den fysiska miljön under stressfria förhållanden. Den här artikeln visar förfarandena för musen utbildning och huvudfixering, och ger representativa exempel där två-photon mikroskopi, inneboende optisk avbildning och patch-clamp inspelningar utförs i hjärnan hos vakna beter möss.
För att bättre förstå hjärnans fysiologi och patologi, får forskningen utföras på en rad olika berednings komplexitet nivåer, att utnyttja de mest lämpliga tekniker för varje preparat. För närvarande finns ett stort utbud av neurovetenskap metoder (från full body fMRI till sub-organell Sted mikroskopi) lätt appliceras på sövda djur, medan experiment på vaken och beter djur har utgjort en betydande metodologiska utmaning.
Här är en ny metod som beskrivs där ett laboratorium djur, trots att de är ordentligt huvud-fast, kan flytta runt en luft-lyfte mobil homecage och utforska sin materiella omgivning under stressfria förhållanden. Huvudet fixerade beter förberedelse djur presenteras här ger ett antal viktiga fördelar. Först, elektrofysiologiska eller bilddata som erhållits med denna metod är kompromisslös varken av anestesi eller av begränsningsinducerande-inducerad stress. Positionering av musen i den mobila hembur är snabb och kräver inte anesthetizing djuret även transient. För det andra säkerställer den luft lyfts homecage den mekaniska stabiliteten som krävs för att kvantifiera förändringar i fin neuronal morfologi och för att spela in encelliga elektrofysiologisk aktivitet i vakna djur. Slutligen är den mobila homecage design mer kompakt i jämförelse med den sfäriska löpband, vilket gör det möjligt att placera den mobila homecage under en standard upprätt mikroskop för två-foton-avbildning eller patch-clamp inspelning i vaken musens hjärna.
Firm huvudet fixering i mobil homecage kräver implantation av en speciellt utformad fyrlängad metallhållare, med en rund öppning i mitten för optisk eller elektrisk åtkomst till den underliggande hjärnregionen. Dessa metallhållare är fäst vid skallen med hjälp av en kombination av lim, dentalcement och en liten bult inskruvad i skallbenet. Det kirurgiska ingreppet har utvecklats baserat på ett stort antal tidigarepublicerade procedurer, och visade sig leda till en stabil och reproducerbar kraniala fönstret förberedelse. För in vivo elektrofysiologiska experiment, en moon-formade fönster 34, en liten storlek kraniotomi (mindre än 0,5 mm) 32, och ett borrat glastäckta beredning 35 har utnyttjats. Här var "inverterad" kraniell fönster implanteras med antingen en stor (3,5 mm diameter) eller liten (mindre än 0,5 mm i diameter) kraniotomi. Minimera hjärnrörelsen är avgörande för stabila encelliga inspelningar, vilket är varför det är lämpligt att utföra mindre storlek craniotomies för elektrofysiologiska experiment. Vid implantation av kraniala fönstret för optisk imaging experiment djuren fick återhämta sig i minst 2 eller 3 veckor, under vilken period fönstret förlorar första gående öppenhet och sedan återfår den (med en 50-70% avkastning, beroende på den genetiska bakgrunden hos musen stam). Insyn i den kraniala fönstret och stabilitetten av tandcement "cap" som bifogas skallen kan verifieras med hjälp av en vanlig kikare mikroskop och fysisk kontroll under djurhantering. Vid slutet av 2-3 veckors återhämtningsperiod bör dessa djur som uppvisar några tecken på kvarvarande post-operativ inflammation eller mekaniska defekter i tandcement uteslutas från experimenten och avslutas.
Den optimala åldern för start utbilda möss är 2-4 månader (motsvarande kroppsvikt 20-40 g). I yngre djur kan förankring av tandcement "cap" till skallen vara opålitlig, vilket kan minska dess motståndskraft mot mekanisk stress som tas ut av förflyttning av huvudet-fast musen i den mobila homecage. Även om han-och honmöss verkar lika villiga att navigera i mobil homecage, finns det en tendens att få en bättre andel av kraniala fönster återfå sin öppenhet i honmöss (data visas ej). Således, för to säkerställa en balanserad blandning av könen i den kohort av djur som valts ut för avbildning, implantera kraniala fönster i ca 30% mer hanmöss rekommenderas. Social interaktion är kända för att förbättra djurens välbefinnande och minska stress, därför är det lämpligt att kullsyskon drivs och utbildas parallellt och hålls samman i grupp-bostäder burar.
I motsats till de förfaranden som publicerats för den sfäriska löpband preparatet 13 är den metod som utnyttjar den mobila homecage inte kräva anesthetizing musen vid den tidpunkt då huvud fixering. Denna skillnad är viktig eftersom den gör det möjligt att utesluta eventuella kvarstående effekter att även en kort och "ljus" anestesi episod kommer sannolikt att ha på de fysiologiska mätvärdena strax efter. I själva verket, även om i de studier där huvudfixering gjordes under narkos och de faktiska experimenten startade efter en kort väntetid 13, kan man inteutesluta eventuella långvariga effekter av kort anestesi episoden på experimentella data. Andra studier har förlitat sig på vattenbrist för systematisk tillvänjning av djuren till huvud fixering och använt vatten belöning som ett sätt att motivera djuret att förbli orörlig 36. Dock begränsar belöningen baserade huvudfixeringsmetod valet av tillämpliga beteendetester och, viktigare, har ett av de väletablerade stimulus-belöning föreningar. Däremot innebär metoden för musen tillvänjning till huvudet fixering i mobila homecage inte kräver vattenbrist och efterföljande belöning.
Med tillägg till den mobila homecage med ett vattenleveranssystem rekommenderas för långvariga experiment. De djur utbildningar och experiment som presenteras här gjordes under dagtid (08:00 till 06:00), vilket motsvarar den fysiologiskt passiva perioden för de möss som hålls under det standardiserade 12-hr ljusschema (lights på vid 06:00 och stänger kl 06:00). Eftersom vattenintaget är direkt förknippad med musen verksamhet, under de passiva perioden mössen inte kräver vatten leverans om längden på en träning / avbildning / inspelning inte överstiger 2 tim. Förutom den tidpunkt och varaktighet för träningen, måste man ta upp frågan om det optimala antalet sessioner som behövs för habituerade djuren till mobil homecage. I detta syfte har två kriterier som används för att utvärdera stress som huvud fixeringen: i) viktminskning, och ii) rörelseaktivitet nivå. Som visas i figur 6, når viktminskning den genomsnittliga nivån på 6% på utbildningsdag 2, och är helt omvända av utbildningsdag 4 (figur 6A). Konsekvent med väger dynamik, är rörelseaktivitet nivån huvud fixerade djur tryckt på den första dagen av utbildning, men stabiliseras efter utbildningsdag 4 (figur 6D). Baserat på dessa mätningar, vi suggest som den minimala längden på musen praktikperiod på mobil homecage är 4 dagar, så som beskrivs i protokollet härmed.
Användning av luft lyfte, platt-golv mobil homecage tillåter lägga komplexa uppgifter (sensomotoriska, perceptional och kognitiva) till utbildnings paradigm för huvud-fasta möss. I den aktuella studien två protokollen för beteendetester presenteras. Båda protokollen använda lukt ledtrådar och kan kombineras med längsgående avbildning / inspelningar i musen cortex. Även den mobila homecage tillverkas av icke absorberande material, måste man ändå ta hänsyn till möjliga interferenser mellan doften av anordningen och provlukt (s). En annan faktor som kan störa visuella / taktila ledtrådar i ett beteendeexperiment är korsningen mellan väggen och insatsen, vilket inte är smidig och kan därför uppfattas av djuret som en milstolpe. Det är värt att lägga märke till här att det, för att minimera djurens lidande under sådan integrerventions som placering av en lukt presenter bomull till mobil homecage väggen bör experimentalist öva att utföra sådana åtgärder så snabbt som möjligt och undvika långvarig hantering av kolet buren. Alternativa strategier för roman lukt / object presentation är tänkbara, t ex att placera hydrogel-baserad lösning, droppar eller föremål (såsom livsmedels chips) på små hyllor bundna till den inre ytan av det kol bur väggen på höjden kompatibel med djurets huvud positionering.
Mobil homecage låter huvud-fast djur för att utföra ett brett utbud av två-dimensionella rörelser inklusive horisontell förflyttning, situp, grooming, vispa, slickar, näsa-peta, skickliga framtassrörelser, och vägg beröring med frambenen, som visas i den aktuella studien . Med hjälp av mobil homecage och de protokoll som presenteras här, kan forskarna studera sensorimotorisk neuronala system med en hög grad av kontroll över både stimulans skicks och de beteendemässiga läs-outs. Dessutom kan studier av kognitiva förmågor i vakna möss utföras under konditionering, rumslig navigering och beslutsfattande uppgifter.
Det finns flera praktiska begränsningar med denna metod. För det första krävs det en betydande mängd av trycksatt luft för att uppnå den homecage-lyftkraft och för att utföra långvariga experiment. För det andra är mobil homecage i nuvarande implementering endast 18 cm i diameter, och ger därför en relativt liten och enkel utrymme i jämförelse med virtuell verklighet, där en komplex experimentell miljö kan utformas utan några rumsliga begränsningar. För det tredje, under morrhår stimulans och belöning baserade experiment som presenteras här, var en anordning som används som begränsar möjligheten vägg-kontakten för musen. Tillsats av en extern visuell eller sensorisk stimulering kanal (till exempel en ögonriktad ljusprojektor) skulle kräva att utforma en mer ergonomisk och kompakt enhet i jämförelse medde multipel-screen-eller kupolprojektions lösningar som har använts i de sfäriska löpband experiment.
Sammanfattningsvis användningen av huvudet fixerade möss som rör sig i luften-lyfte mobil homecage underlättar i hög grad de studier som kombinerar cell-, molekylär-och beteendemässiga nivåer av observation och manipulation i ett enda experiment. Specifika tillämpningar illustreras här omfattar två-photon mikroskopisk avbildning, inneboende optisk signal avbildning och patch-clamp inspelningar i icke sövda beter möss. Det förväntas att denna strategi kommer att öppna nya möjligheter för ett experiment på vaken, beter mus och fungera som ett användbart verktyg för både läkemedelsutveckling och grundläggande forskning av hjärnans funktion.
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Prof. Eero Castren för hans värdefulla synpunkter på manuskriptet. Arbetet stöds av bidrag från Finlands Akademi, Centret för internationell mobilitet i Finland, samt finska forskarskolan för neurovetenskap (hjärna och sinne Doctoral Program).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Tweezers Stainless Steel, 115mm | XYtronic | XY-2A-SA | |
Animal trimmer, shaving machine | Aesculap | Isis GT420 | |
Binocular Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | Supertech | TMP-5b | |
Blunt microsurgical blade | BD | REF 374769 | |
Borosilicate tube with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | For patch pipette production |
Camera | Foscam | FI8903W | Night visibility |
Carprofen | Pfizer | Rimadyl vet | |
Dental cement | DrguDent, Dentsply | REF 640 200 271 | |
Dexamethasone | FaunaPharma | Rapidexon vet | |
Disposable drills | Meisinger | HP 310104001001008 | |
Dulbeco’s PBS 10X | Sigma | D1408 | |
Dumont #5 forceps, 110 mm | FST | 91150-20 | |
Eyes-lubricant | Novartis | Viscotears | For eyes protection during operation and as viscose solution for immersion |
Foredom drill control | Foredom | FM3545 | |
Foredom micro motor handpiece | Foredom | MH-145 | |
Four-winged metal holder | Neurotar | ||
Head Holder for Mice | Narishige | SG-4N | Assembled on stereotaxic instrument |
Hemostasis Collagen Sponge | Avitene, Ultrafoam BARD | Ref 1050050 | |
Imaris | Bitplane | ||
Ketamine | Intervet | Ketaminol vet | |
Kwik-Sil | WPI | ||
Mai Tai DeepSee laser | Spectra-Physics | ||
Micro dressing forceps, 105 mm | Aesculap | BD302R | |
Microelectrode puller | Narishige | PC-10H | Vertical puller for glass pipette production |
Micromanipulator | Sensapex | ||
Mini bolt | Centrostyle | Ref. 00343 s/steel M1.0x4.5 | |
Mobile Homecage | Neurotar | ||
Multiphoton Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000MPE | |
Nonwoven swabs 5×5 | Molnlycke Health Care | Mesoft | Surgical tampons |
Polyacrylic glue | Henkel | Loctite 401 | |
Round glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | ||
1.5 thickness | |||
Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
Student iris scissors, straight 11.5 cm | FST | 91460-11 | |
Xylazine | Bayer Health Care | Rompun vet |