견인 힘 현미경의 세포 배양 표면 근처 지역화 기자 형광 구슬을위한 새로운 방법
Summary
형광 프로브를 함유하는 폴리 아크릴 아미드 (PA) 겔을 제조하기위한 전통적인 기술은 접착 표면 및 유리 슬라이드 사이에 겔을 개재 포함한다. 여기서, 우리는 폴리-D-라이신 (PDL) 및 형광 프로브이 슬라이드 코팅은 겔 표면으로부터 1.6 μM 내로 프로브 지역화 것을 보여준다.
Abstract
PA 젤 긴 제조 및 조정 자신의 탄성을 할 수있는 기능의 용이성으로 인해 세포 견인 힘을 연구하기위한 플랫폼으로 사용되어왔다. 기판은 세포 외 기질 단백질로 코팅되는 경우, 세포 부착 및 겔 겔 변형 일으키는 힘을 적용한다. 변형은 세포 견인 및 겔의 탄성 특성에 의존한다. 표면 변형 필드가 알려진 경우, 표면 정지 마찰은 탄성 론을 이용하여 계산 될 수있다. 겔 변형은 일반적으로 균일하게 겔화 형광 마커 비드 매립에 의해 측정된다. 젤 변형으로 프로브는 변위. 겔의 표면 근처에 프로브를 추적됩니다. 이러한 프로브에 의해보고 된 변위는 표면 변위로 간주됩니다. 표면에서 그들의 깊이는 무시됩니다. 이 가정은 견인력 평가에 오류를 소개합니다. 비드의 위치가 알려 져야하는 셀의 힘의 정확한 측정을 위해, 중요하다. 우리는 개발표면의 1.6 μm의 내 PA 젤에, 형광 마커 구슬, 직경 0.1 μm의 한을 제한하는 간단한 화학을 활용하는 기술. 우리는 코트 폴리-D-라이신 (PDL)과 형광 구슬 커버 슬립. PA 겔 용액을 커버 슬립과 접착면 사이에 개재된다. 형광 비드가 경화 중에 겔 용액에 옮긴다. 중합 후, PA 겔은 겔 표면에 비행기 주변에 형광 구슬이 포함되어 있습니다.
Introduction
로컬 환경과 살아있는 세포의 기계적 상호 작용은 일반적으로 PA 젤을 이용하여 연구하고있다. 이러한 기판이 기판의 주요 이점 중 하나. 한 1997 Dembo 및 왕에 의해 설립 간단한 잘 특성화 프로토콜에 의존하는 그들의 강성 겔 용액의 특정 구성 요소의 농도를 변경함으로써 조절 될 수 있다는 것이다. 이것은 서로 다른 강성의 환경과 세포의 상호 작용을 연구하는 것이 바람직 플랫폼을 제공합니다. PA 젤은 세포 외 기질 (ECM) 단백질로 코팅하는 경우, 세포가 힘을 생성,이를 준수합니다. 셀 힘의 결과로,이 겔 탄성체로 변형된다. 이 변형은 세포 및 겔의 탄성 특성에 의해 가해지는 힘의 크기에 따라 달라진다. 다양한 연구 셀룰러 견인 세력을 조사하기 위해 PA 젤을 사용했다.
PA 겔 제조의 한 변형에서, 형광 마이크로 스피어 (구슬) t을 포함하는다른 경직성이의 젤에 세포 견인 힘을 정량화하기 위해 젤을 hroughout. 셀 힘 부여되면, 비즈 겔 변형 전의 초기 위치로부터 변위. 변형 필드는 각각의 비드로부터의 변위를 측정한다. 이 변형 필드는 탄성 이론 및 견인력을 계산하는 겔의 탄성 특성과 함께 이용된다. 이러한 측정은 세포가 기계적으로 감지하고 해당 지역의 미세 세와 상호 작용하는 방법에 대한 통찰력을 제공합니다.
많은 널리 사용되는 PA 겔 제조 프로토콜에서 구슬은 액체의 비중 합 상태에서 PA 젤에 걸쳐 혼합된다. 완전히 중합 PA 젤은 볼륨에 걸쳐 형광 구슬이 포함되어 있습니다. 셀 견인력을 계산할 때, 겔 표면 (셀 기판 계면)에 가까운 가장 구슬 모니터링된다. 이러한 비드의 변위는 하중 calculatio의 간략화를 위해 세포 배양 표면에서 발생하는 것으로 가정명. 겔의 깊이 내의 비드의 실제 위치는 무시된다. 그러나, 탄성 매체 (예 PA 겔 등), 힘 적용 점에 가까운 비드 멀리 포인트로부터 비드보다 더 이동한다. 따라서, 셀룰러 트랙션의 과소에 표면에 그 결과로서 표면으로부터 말단 (비드 위치에서) 점의 변위를 치료. 에러의 정도는 표면으로부터의 비드의 거리에 의존한다. 오류가 비드의 위치의 지식없이 추정 될 수 없다.
매우 세포 배양 표면 근처 비드를 한정하는 간단한 방법의 필요성이 몇 가지 기술에 의해 해결되었다. 하나의 방법은 매우 표면 근처 움직임을 측정하는 상부 초점면에 비드 충분한 숫자가되도록 전체에 걸쳐 겔 비드의 밀도를 증가시키는 것이다. 또 다른 기술은 광으로부터 생균 이미징 촛점 촬상 챔버 건물 포함최상위 초점 평면에서만 비드 (4)를 수집한다. 다른 방법은 구슬 다섯없이 이미 중합 된 겔의 상단에 구슬을 포함하는 PA 젤의 매우 얇은 층을 오버레이 포함한다. 이러한 기술의 각각의 단점은 겔 내의 비드의 정확한 위치를 알 수없는 점이다. 이 비드의 변위 필드, 따라서 세포의 힘의 계산의 계산에 오류를 소개한다. 또 다른 기술은 설포 SANPAH 6을 이용하여 이미 중합 PA 겔의 상면에 접합 비드를 포함한다. 이 기술은 비드 만 PA 겔 위에 실로 보장하지만, 그들은 겔의 깊이에 매립되어있는 정도를 알 수있다. 이전 작품은 세포가 힘 마이크론 멀리 칠을 감지 할 수 있음을 제안했다 이것은 잠재적으로 세포의 동작을 변경할 수있는 세포에 대한 지역의 지형을 만들 수 있습니다. 최근에, 1 μm의 직경 F와 PA 젤을 패터닝하는 기술정규화 배열 luorescent 피브로넥틴 도트 마커 팔을 설립되었습니다. 이 경우, 형광 마커의 깊이가 알려져 있으며, 피브로넥틴 패턴 간접적 겔 표면 상에 인쇄 될 때, 본질적으로 제로이다. 그러나,이 방법은 ECM 단백질 1 μm의 직경 도트로 한정되는 바와 같이 세포가 부착 할 수있는 연속적인 환경을 제공하지 않는다. 완전히 매우 표면 근처 알려진 위치 PA 겔 내에 추적기 구슬을 통합하고이를 한정하는 방법이 아직 확립되어야한다.
여기서, 우리는 매우 PA 겔 내의 세포 배양 표면 근처 초점면에 μm의 직경 형광 비드 부 μM을 제한하는 기술을 개발한다. 겔은 전형적으로 두 개의 유리판 사이에 미 중합 액체 겔 용액을 개재하여 경화된다. 겔에 강하게 밀착되도록 플레이트 중 하나가 작용된다. 다른 작용 화하고 겔 경화 후에 제거된다. 우리는이 이동식 유리 스와 수정비즈의 층으로 코팅하여 rface. 기능화 및 비드 코팅 유리 표면 사이의 액체 겔을 끼운 후, 겔 비드 전송은 경화된다. 이것은 표면의 1.6 μM 내의 겔화 구슬 '통합의 거리를 제한한다. 유리 바닥 페트리 접시는 젤이 경화되는 부착면으로 사용된다. 중합시 겔 평면형 표면을 형성하도록, 원형 유리 커버 슬립이 샌드위치에 유리 바닥 페트리 접시와 겔을 사용한다. 겔의 제조에 앞서, 상부 유리 커버 슬립은 양성 표면 전하를 산출, 폴리-D-라이신 (PDL)로 코팅된다. PDL은 압축 공기를 분출하고, 물에 비드 용액 커버 슬립 상에 증착된다. 우리는 음전하를 운반 카르 형광 마이크로 비즈를 이용하고, PDL로 처리하여 생성 된 양으로 대전 된 표면과 상호 작용. 압축 공기의 단일 층 커버 슬립 오프 비드 용액을 불어 후에구슬은 정전 건조 커버 슬립에 연결 상태를 유지합니다. 유리 슬라이드가 완전히 손상되지 않은 그대로 PA 겔로부터 제거됨에 따라 PDL 코팅은 겔 표면에 유리의 접착에 영향을 미치지 않는다.
유리 바닥 페트리 접시는 97 % 3 – 아미노 프로필 – trimethoxysliane 및 0.5 % 글 루타 알데하이드 (glutaraldehyde)로 처리하여 부착 만들어집니다. 원하는 경직성의 PA 젤은 표준 절차 구를 통해 비스 아크릴 아미드와 아크릴 아미드의 적절한 농도를 혼합하여 만들어집니다. 겔 용액의 액체 방울은 유리 바닥 배양 접시 상에 피펫 팅한다. 비드를 함유 유리 커버 슬립이 샌드위치에 페트리 접시와 겔을 사용한다. 겔이 경화 될 때, 상단 커버 슬립은 표면으로부터 1.6 μM 내에 PA 겔에 포함 된 비드를 남겨 제거된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 방법을 사용할 때, 비드 용액 적절히 희석 및 비즈 원하는 직경에 기초하여 선택되는 것이 필수적이며, PA 겔 기판 강성이고 원하는 실험 탐구되는 현상의 크기 스케일.
상단 유리 커버 슬립을 기능화하기 전에 비드 솔루션을 희석 할 때주의를 기울여야한다. 겔 표면에 구슬 사이의 간격은 콜로이드 용액의 희석 배수를 변화시킴으로써 변경 될 수있다. 너무 용액을 희석하?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 학제 간 혁신 이니셔티브 프로그램, 일리노이 대학을 감사드립니다, 12035을 부여합니다. SK는 국립 과학 재단 (NSF) 부여에서 UIUC에 투자되었다 0,965,918 IGERT : 세포 및 분자 역학 및 BioNanotechnology에 연구원의 차세대를 훈련.
Materials
| Name | Company | Catalog Number |
| Reagents | ||
| 97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES) | Sigma-Aldrich | 281778 |
| 70% Glutaraldehyde | Polysciences, Inc. | 111-30-8 |
| 1M HEPES buffer solution | Sigma-Aldrich | 83264 |
| 40% Acrylamide | Sigma-Aldrich | A4058 |
| 2% Bisacrylamide | Sigma-Aldrich | M1533 |
| 0.1 um Fluorescent microspheres (mCherry) | Invitrogen | F8801 |
| Fibronectin, Human, 1mg | BD Biosciences | 354008 |
| Ammonium Persulfate | Bio-RAD | 161-0700 |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-RAD | 161-0801 |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E |
| 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) | Thermo Scientific | 22980 |
| N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) | Thermo Scientific | 24500 |
| .05% Trypsin-EDTA (1X) | Life Technologies | 25300-054 |
| NaCL | Sigma-Aldrich | S9888 |
| Acrylic Acid | Sigma-Aldrich | 147230 |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M3671 |
| Materials | ||
| 35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glass | In Vitro Scientific | D35-14-1-N |
| Glass cover slips, 12 mm diam. | Ted Pella, Inc. | 26023 |
Riferimenti
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