Riportiamo un dispositivo ed un nuovo metodo per studiare le cellule ed embrioni. celle singole sono proprio ordinati in array microcavità. Il loro confinamento 3D è un passo verso ambienti 3D incontrate in condizioni fisiologiche e permette l'orientamento organelli. Controllando la forma delle cellule, questa configurazione riduce al minimo la variabilità riportata nei test standard.
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Articolo metodologico
Ordinazione di singole cellule e singola embrioni in 3D confinamento: Un nuovo dispositivo per l'alta Screening contenuti
In questo articolo
Sommario
Abstract
cellule biologiche si osservano di solito su superfici piane (2D). Questa condizione non è fisiologico, e fenotipi e le forme sono molto variabili. Lo screening basato su cellule in tali ambienti sono quindi gravi limitazioni: organelli cellulari mostrano fenotipi estremi, morfologie di cellule e le dimensioni sono organelli cellulari eterogenee e / o specifiche non possono essere adeguatamente visualizzati. Inoltre, le cellule in vivo si trovano in un ambiente 3D; in questa situazione, le cellule mostrano diversi fenotipi principalmente a causa della loro interazione con la circostante matrice extracellulare del tessuto. Al fine di standardizzare e generare ordine delle singole cellule in un ambiente 3D fisiologicamente rilevanti per saggi cellulari, riportiamo qui la microfabbricazione e le applicazioni di un dispositivo per vitro coltura cellulare 3D. Questo dispositivo è costituito da una matrice 2D di microcavità (tipicamente 10 5 cavità / cm 2), ciascuna riempita di singole cellule o embrioni. cellulare posizione, la forma, la polarità e l'organizzazione interna delle cellule diventano poi normalizzato che mostra un'architettura 3D. Abbiamo usato stampaggio replica a modello una serie di microcavità, (PDMS) strato 'portauova', SU UN polidimetilsilossano sottile aderito su un vetrino. Cavità sono state coperte con fibronectina per facilitare l'adesione. Le cellule sono state inserite mediante centrifugazione. percentuale di riempimento è stato ottimizzato per ciascun sistema consentendo fino al 80%. Le cellule ed embrioni viabilità è stata confermata. Abbiamo applicato questa metodologia per la visualizzazione di organelli cellulari, quali apparati nucleo e Golgi e studiare processi attivi, come la chiusura dell'anello cytokinetic durante la mitosi cellulare. Questo dispositivo ha permesso l'identificazione di nuove caratteristiche, come accumuli periodici e disomogeneità di miosina e actina durante la chiusura dell'anello cytokinetic e fenotipi compattati per Golgi e l'allineamento nucleo. Abbiamo caratterizzato il metodo per cellule di mammifero, lievito di fissione, lievito in erba, C. elegans wesimo adattamento specifico per ogni caso. Infine, le caratteristiche di questo dispositivo lo rendono particolarmente interessante per saggi di screening di farmaci e medicina personalizzata.
Introduzione
Di corrente in saggi cellulari in vitro sono bidimensionali (2D). Questa configurazione non è naturale per le cellule di mammifero e pertanto non è fisiologicamente rilevanti 1; cellule mostrano una varietà di forme, dimensioni e fenotipi eterogenee. Essi presentano gravi limitazioni aggiuntive quando applicato alle applicazioni di screening, come ad esempio una distribuzione disordinata all'interno del piano e fenotipi estremi di organelli cellulari (fibre di stress, in particolare). Ciò è particolarmente importante in studi clinici per i test di droga, in cui i budget elevati vengono spesi ogni anno. La maggior parte di que....
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Protocollo
1. Microfabbricazione di 'Portauova'
- Realizzazione del Master: microcavità Array
- Scaldare un wafer 3 '' di silicio fino a 200 ° C per evaporare l'eventuale presenza di umidità.
- Spin-coat un sottile strato di SU-8 fotosensibile. Regolare il volume di resina e filatura velocità a seconda del tipo e dello spessore photoresist desiderato. Questo spessore detterà la profondità dei 'portauova' (EC). Per uno strato spesso 30 micron e SU-8 2025, spin-coat a 2.800 giri al minuto.
- Pre-cuocere il wafer a 65 ° C per 1 min (passaggio 1 di 2) per uno spesso strato 30 micron SU-8 il 2025. Adattare il tempo a second....
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Risultati
Le '' portauova (CE) sono un metodo di screening ad alto contenuto-romanzo che permette la visualizzazione di cellule orientate ed embrioni in un ambiente 3D. Inoltre, alcuni processi cellulari, che sono difficili da osservare nelle culture standard, 2D (flat), possono essere osservati da questo nuovo metodo. La figura 1a mostra una sintesi della procedura per la microfabbricazione CE (vedi anche la sezione 1 del protocollo sopra descritto ). Il metodo è semplice, veloce, efficiente e senza alcun requis.......
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Discussione
stampaggio replica è stato utilizzato per fabbricare i 'portauova. Il processo di fabbricazione non ha bisogno di una camera pulita; è facile e semplice, anche se una certa pratica può essere richiesto. In particolare, rilasciando il timbro PDMS è la fase più critica per produrre una vasta area di 'portauova' alta qualità. Per questo motivo, particolare attenzione deve essere presa in questo passo. Se questo passaggio è più volte fallendo, prendere in considerazione per ottimizzare i parametri del plasma pul.......
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Dichiarazioni
Non abbiamo nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Riconosciamo L. Brino (impianto di screening Content IGBMC alta, Illkirch, Francia) per averci fornito l'anticorpo anti-Giantin, M. Labouesse Lab. per C. elegans (IGBMC) e B. Séraphin Lab. per il lievito (IGBMC), E. Paluch e A. Hyman per le cellule HeLa fluorescenti (MPI-CBG, Dresda), J. Moseley (Dartmouth Medical School) e JQ Wu (Ohio State University) per le cellule di lievito di fissione; A. Hoël e F. Evenou aiuto sperimentale, C. Rick (IBMC, Strasburgo, Francia) per assistenza tecnica, e JC Jeannot (Femto-st, Francia) per un aiuto nella microfabbricazione. Questo lavoro è stato sostenuto da fondi del CNRS, l'Università di Strasburgo, Conectus, ....
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Materiali
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<<CO<
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| ddH20 (ultrapuro) | Millipore-Utilizzare | sempre acqua fresca. | |
| Parafilm (film plastico) | Bemis | PM-999 | Far aderire il Parafilm al banco da laboratorio utilizzando alcune gocce d'acqua e garantire una perfetta planarità della superficie. |
| Foto-maschera | Selba | - | http://www.selba.ch |
| Wafer di silicio | Siltronix | - | http://www.siltronix.com/ |
| SU-8 fotoresist | MicroChem | serie 2000 | http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm |
| è necessario lavorare in una cappa aspirante; per ulteriori informazioni, consultare la scheda tecnica del produttore. | |||
| Sviluppatore SU-8 | MicroChem | - | http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm |
| è necessario lavorare in una cappa aspirante; controllare la scheda tecnica del produttore per ulteriori informazioni | |||
| 2-propanolo | Sigma-Aldrich | 19030 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en& region=CA |
| Disponibile da più aziende. | |||
| Sigmacote (reagente siliconizzante) | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr& regione=FR">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr& regione=FR |
| >dannoso, è necessario lavorare in una cappa aspirante; controlla la scheda tecnica del produttore per ulteriori informazioni. | |||
| Clorotrimetilsilano (TMCS) | Sigma-Aldrich | 386529-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr®ion=FR |
| TMCS produce tossicità acuta per inalazione e per via cutanea, ed è altamente infiammabile (con ritorno di fiamma di accensione in grado di verificarsi a distanze considerevoli), di conseguenza dovrebbe essere utilizzato in una cappa aspirante lontano da fonti di accensione | |||
| Guanti in nitrile | Kleenguard | 57372 | http://www.kcprofessional. com/products/ppe/guanti-mani/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m |
| Disponibile da più aziende. | |||
| Vetrini coprioggetti #0 | Vetro lavorato a maglia | KN00010022593 | http://www.knittelglass.com/index_e.htm |
| Molto fragile. Manipolare delicatamente. | |||
| Pinzetta dritta affilata | SPI | 0WSSS-XD | http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7 |
| tubo da 50 ml | BD Falcon | 352070 | http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp |
| Disponibile da diverse aziende. | |||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 kit | http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx? R=131EN |
| La confezione contiene sia la base PDMS che l'agente indurente. Elastomeri simili sono disponibili da più aziende. | |||
| Vetrini per microscopio | Dutscher | 100001 | http://www.dutscher.com/frontoffice/search |
| Disponibile da diverse aziende. | |||
| DMEM mezzo ad alto contenuto di glucosio | Fisher Scientific | 41965-039 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search? LBCID=12301479& keyWord=41965-039& store=Scientifico& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD |
| Siero di vitello bovino | Sigma-Aldrich | C8056-500ML | a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en& regione=CA">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en& regione=CA |
| 0,25% Tripsina-EDTA | Fisher Scientific | 25200-072 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072& store=Scientifico& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD |
| PBS 1x | Fisher Scientific | 14200-067 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067& store=Scientifico& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD |
| PBS è a 10x e dovrebbe essere diluito a 1x utilizzando ddH2O | |||
| L-15 medium | Fisher Scientific | 21083-027 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027& store=Scientifico& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD |
| Medium per atmosfere senza controllo | |||
| Fibronectina | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& termine=F1141-5MG& lang=en& regione=CA& focus=prodotto& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax |
| Penicillina & Streptomicina | Fisher Scientific | 15140-122 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122& store=Scientifico& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=CHEM |
| Piastra di Petri P35 | Greiner | 627102 | http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/ |
| Piastra di Petri P60 | Greiner | 628163 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/ |
| Piastra di Petri P94 | Greiner | 633179 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/ |
| Paraformaldeide 3 % | Sigma-Aldrich | P6148-500G | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr& regione=FR |
| Dannoso in particolare per gli occhi, è necessario lavorare in una cappa aspirante; controllare la scheda tecnica del produttore per ulteriori informazioni. | |||
| Triton 0,5 % | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& termine=93443-100ML& lang=en& regione=CA& focus=prodotto& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax |
| Phallodin-Green Fluorescent Alexa Fluor 488 | InVitrogen | A12379 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379? CID=ricerca-a12379 |
| sciogliere la polvere in 1,5 ml di metanolo | |||
| Alexa Fluor 647 | InVitrogen | A21245 | diluizione 1:200 in PBS 1x |
| coniglio policlonale anti-Giantin | Abcam | ab24586 | diluizione 1:500 in PBS 1x |
| http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html | |||
| coniglio anti-anillina | Per gentile concessione di M. Glotzer, pubblicato in Piekny, A. J. & Glotzer, M. L'anillina è una proteina dell'impalcatura che collega RhoA, actina e miosina durante la citochinesi. Biologia attuale 18, 30– 6 (2008). | Diluizione 1:500 in PBS 1x | |
| Laboratorio di trasduzione | anti-fosfotirosina | 610000 | http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000 |
| Cy3 capra anti-coniglio | Jackson Immunoresearch | 111-166-047 | http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp |
| 1:1.000 diluizione in PBS 1x | |||
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr& regione=FR |
| 1 mg/ml per 1 min | |||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& termine=G2025& lang=en& regione=CA& focus=prodotto& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax |
| Olio minerale | Sigma-Aldrich | M8410-500ML | a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& termine=M8410-500ML& lang=en& regione=CA& focus=prodotto& N=0+220003048+219853082+219853286& modalità=corrispondenza%20parzialemax">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& termine=M8410-500ML& lang=en& regione=CA& focus=prodotto& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax |
| Cellule HeLa | - | - | Le cellule di mammifero sono disponibili presso molte aziende. Vedi anche Tabella 1 |
| NIH3T3 Le cellule | ATCC-Mammalian | sono disponibili presso molte aziende. Vedi anche Tabella 1 | |
| Lievito di fissione | - | - | Per dettagli sui ceppi, contattare l'autore corrispondente. Vedi anche Tabella 1 |
| C. elegans worms | - | - | Per i dettagli, contattare l'autore corrispondente. Vedi anche Tabella 1 |
| YES (Agar) + 5 Supplementi inclusi | MP Biomedicals | 4101-732 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732& s=Cerca |
| Per la preparazione: seguire le istruzioni riportate sulla confezione | |||
| SÌ (Media) + 5 Integratori inclusi | MP Biomedicals | 4101-522 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522& s=Cerca |
| Per la preparazione: seguire le istruzioni riportate sulla confezione | |||
| EMM (Media) | MP Biomedicals | 4110-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012& s=Cerca |
| Per la preparazione: seguire le istruzioni riportate sulla confezione | |||
| Filtro sterilizzato EMM (Media) - Solo per imaging | MP Biomedicals | 4110-012 | Per la preparazione: seguire le istruzioni riportate sulla confezione. Filtro sterilizzare il terreno utilizzando un 0,22 µ filtro m invece della sterilizzazione in autoclave. Questo conferisce trasparenza al mezzo e riduce l'autofluorescenza. |
| Integratori (per EMM) | MP Biomedicals | 4104-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012& s=Ricerca |
| ( Aggiungere 225 mg/L nel terreno EMM prima della sterilizzazione in autoclave o del filtraggio) | |||
| Filtri sterili Stericup e Steritop Vaccum | Millipore | - | http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare& tab1=2& tab2=1#tab2=1:tab1=2 |
Riferimenti
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Thery, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab Chip. 9, 1640-1642 (2009)....
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Ristampe e permessi
