Descriviamo qui un metodo migliorato di trasferimento Luminescence Resonance Energy (lRet) dove introduciamo un sito proteasi scissione tra i siti fluoroforo donatore e accettore. Questa modifica ci permette di ottenere segnali lRet specifici derivanti dalle proteine di membrana di interesse, consentendo lo studio di proteine di membrana, senza purificazione della proteina.
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Articolo metodologico
Luminescence Resonance Energy Transfer allo Studio conformazionale Cambiamenti nella membrana proteine espresse in cellule di mammifero
In questo articolo
Sommario
Abstract
Trasferimento Luminescence Resonance Energy, o lRet, è una potente tecnica utilizzata per misurare le distanze tra due siti nelle proteine all'interno della gamma distanza di 10-100 Å. Misurando le distanze in diverse condizioni legatura, cambiamenti conformazionali della proteina possono essere facilmente valutati. Con lRet, un lantanidi, terbio il più delle volte chelato, è utilizzato come fluoroforo donatore, offrendo vantaggi quali una maggiore durata unico donatore-emissione, la flessibilità di utilizzare più fluorofori accettore, e la possibilità di rilevare le emissioni accettore sensibilizzata come un modo semplice misurare trasferimento di energia senza il rischio di rilevare anche solo segnali donatori. Qui, descriviamo un metodo per utilizzare lRet sulle proteine di membrana espresse e testati sulla superficie delle cellule di mammifero intatte. Introduciamo un sito proteasi scissione tra la coppia fluoroforo lRet. Dopo aver ottenuto il segnale lRet originale, scissione in quel sito rimuove il segnale lRet specifica proteina diinteresse che ci permette di sottrarre quantitativamente il segnale di fondo che rimane dopo la scissione. Questo metodo consente una più fisiologicamente rilevanti misurazioni da effettuare, senza la necessità di purificazione di proteine.
Introduzione
Trasferimento Luminescence Resonance Energy (lRet) è un derivato del ben noto Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) tecnica 1. Simile a preoccuparsi, lRet può essere utilizzato per misurare le distanze e le variazioni di distanza tra fluorofori donatore e accettore collegati a siti specifici sulla proteina di interesse all'interno della gamma di 10-100 Å 1-3. I principi della lRet sono simili a FRET dal fatto che il trasferimento di energia di risonanza si verifica tra due fluorofori prossimali quando lo spettro di emissione del fluoroforo donatore si sovrappone con lo spettro di assorbimento del fluoroforo accettore. L'efficienza di que....
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Protocollo
1 Creare il Construct contenente la proteina di interesse
Clonazione del gene che esprime la proteina di interesse in un vettore adatto. Utilizzare i vettori come la serie pcDNA o pRK5 in quanto sono adatti per l'espressione in sistemi di mammiferi come le cellule HEK293 e CHO.
2. selezionare i siti sulla proteina per essere etichettate con fluorofori
- Scegliere siti di etichettatura che sono in grado di riflettere eventuali cambiamenti conformazionali all'interno della proteina. Se possibile, utilizzare una struttura cristallina della proteina o di una proteina omologa per contribuire a rendere questa....
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Risultati
Una misurazione lRet successo con un donatore lantanide dovrebbe avere un donatore solo vita nell'intervallo di tempo millisecondi. La durata di emissione lRet sensibilizzati per la proteina marcata con sia il donatore e l'accettore sarà notevolmente più breve, con una durata nel range microsecondo dopo sottrazione del fondo Figura 3. Proteasi risultati scissione in un aumento della vita che dovrebbe diventare stabile nel tempo ( cioè cambiando non più), mostrando che la scissione della proteas.......
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Discussione
LRet è una potente tecnica che permette agli scienziati di misurare le distanze tra i domini all'interno di una singola proteina, come pure tra subunità di una proteina multimerica. Come tale, lRet è adatto a esaminare i cambiamenti conformazionali e dinamiche di proteine o altre macromolecole. Il protocollo di cui sopra dovrebbe consentire il laboratorio adeguatamente attrezzato per testare facilmente le loro ipotesi; tuttavia, ci sono molte fonti comuni di errore che possono affliggere il nuovo investigatore. Se.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health di Grant GM094246, l'American Heart Association di Grant 11GRNT7890004, e la National Science Foundation sovvenzione MCB-1110501.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| LanthaScreen Tiolo Reattivo Tb Chelato | Life Technologies | PV3579 | |
| Accettore fluoroforo-Fluoresceina-5-Maleimmide | Life Technologies | F-150 | La scelta dell'accettore dipende dall'esperimento specifico |
| Accettore fluoroforo-Alexa Fluor 488 C5 Maleimide | Life Technologies | A-10254 | La scelta dell'accettore dipende dall'esperimento specifico |
| Accettore fluoroforo-Alexa Fluor 555 C2 Maleimide | Life Technologies | A-20346 | La scelta dell'accettore dipende dall'esperimento specifico |
| Accettore fluoroforo-Alexa Fluor 594 C5 Maleimide | Life Technologies | A-10256 | La scelta dell'accettore dipende dall'esperimento specifico |
| Accettore fluoroforo-Alexa Fluor 680 C2 Maleimide | Life Technologies | A-20344 | La scelta dell'accettore dipende dall'esperimento specifico |
| QuantaMaster 3-SS | Photon Technology | dovrebbe avere un'eccitazione pulsata con la capacità di misurare tempi di vita nell'ordine dei millisecondi | |
| internazionale FluoreScan 2.0 | Photon Technology | utilizzato nel manoscritto. Software fornito con lo strumento a fluorescenza | |
| Origin 8.6 | OriginLab | Origin è il software di analisi dei dati utilizzato nel protocollo. Può utilizzare altri software di analisi dei dati simili | |
| Cuvetta al quarzo | Starna Cells, Inc | 3-Q-10 | |
| Barra di agitazione | Prodotti Bel-Art | F37119-0007 | Utilizzato in cuvetta per mantenere le celle in sospensione. Può utilizzare qualsiasi ancoretta che si adatti alla cuvetta |
Riferimenti
- Selvin, P. R. Principles and biophysical applications of lanthanide-based probes. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 31, 275-302 (2002).
- Stryer, L., Haugland, R. P. Energy transfer:....
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Ristampe e permessi
