Luminescence प्रतिध्वनि ऊर्जा स्तनधारी कोशिकाओं में व्यक्त झिल्ली प्रोटीन में गठनात्मक परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए स्थानांतरण
Summary
हम यहाँ हम दाता और स्वीकर्ता फ्लोरोफोरे साइटों के बीच एक प्रोटीज दरार साइट परिचय जहां एक बेहतर Luminescence प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (LRET) विधि का वर्णन. इस संशोधन हमें प्रोटीन शुद्धि के बिना झिल्ली प्रोटीन के अध्ययन के लिए अनुमति ब्याज की झिल्ली प्रोटीन, से उत्पन्न होने वाली विशिष्ट LRET संकेतों को प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है.
Abstract
Luminescence प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण, या LRET, 10-100 ए की दूरी सीमा के भीतर प्रोटीन में दो साइटों के बीच दूरी को मापने के लिए इस्तेमाल किया एक शक्तिशाली तकनीक है. विभिन्न ligated परिस्थितियों में दूरी को मापने के द्वारा, प्रोटीन के गठनात्मक परिवर्तन आसानी से मूल्यांकन किया जा सकता. LRET, एक lanthanide, सबसे अधिक बार chelated टर्बियम के साथ, इस तरह के एक लंबी दाता केवल उत्सर्जन जीवनकाल, कई स्वीकर्ता fluorophores उपयोग करने के लिए लचीलापन, और एक आसान तरीके के रूप में अवगत स्वीकर्ता उत्सर्जन का पता लगाने के लिए अवसर के रूप में लाभ affording, दाता फ्लोरोफोरे के रूप में प्रयोग किया जाता है भी दाता ही संकेत का पता लगाने के जोखिम के बिना ऊर्जा हस्तांतरण को मापने के लिए. यहाँ, हम झिल्ली प्रोटीन व्यक्त की और बरकरार स्तनधारी कोशिकाओं की सतह पर assayed पर LRET उपयोग करने के लिए एक विधि का वर्णन. हम LRET फ्लोरोफोरे जोड़ी के बीच एक प्रोटीज दरार साइट परिचय. मूल LRET संकेत प्राप्त करने के बाद, उस साइट पर दरार के प्रोटीन से विशिष्ट LRET संकेत को हटाहमें मात्रात्मक दरार के बाद बनी हुई है कि पृष्ठभूमि संकेत घटाना करने की अनुमति ब्याज. इस विधि अधिक physiologically प्रासंगिक माप प्रोटीन की शुद्धि के लिए आवश्यकता के बिना किए जाने के लिए अनुमति देता है.
Introduction
Luminescence प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (LRET) प्रसिद्ध प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) तकनीक 1 के व्युत्पन्न है. झल्लाहट के लिए इसी प्रकार, LRET 10-100 एक 1-3 की सीमा के भीतर ब्याज की प्रोटीन पर विशिष्ट साइटों से जुड़ी दाता और स्वीकर्ता fluorophores के बीच दूरी और दूरी परिवर्तनों को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. LRET के सिद्धांतों दाता फ्लोरोफोरे के उत्सर्जन स्पेक्ट्रम स्वीकर्ता की fluorophore अवशोषण स्पेक्ट्रम के साथ ओवरलैप जब दो समीपस्थ fluorophores के बीच होता भी है कि प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण में झल्लाहट करने के लिए समान हैं. इस स्थानांतरण की दक्षता निम्नलिखित समीकरण द्वारा दो fluorophores के बीच की दूरी से संबंधित है:
Eq. 1
अनुसंधान दो fluorophores के बीच की दूरी है, जहां ई एन की दक्षता हैनीचे चर्चा ऊर्जा हस्तांतरण, और आर 0,, स्थानांतरण की दक्षता आधा अधिक से अधिक है, जिस पर दूरी यानी फ्लोरोफोरे जोड़ी के लिए फोर्स्टर त्रिज्या है. इस समीकरण से, एक कि दक्षता उलटा छठी शक्ति 1 के लिए उठाया दूरी की भयावहता से संबंधित है देख सकते हैं. यह जब झल्लाहट जोड़ी के आर 0 के पास भी छोटी दूरी परिवर्तन करने के लिए उत्कृष्ट संवेदनशील होने की झल्लाहट और LRET माप के लिए अनुमति देता है कि यह उलटा छठे सत्ता निर्भरता है. विशेष रूप से प्रोटीन या अन्य अणुओं पर वांछित साइटों लेबल करने की क्षमता एक गठनात्मक परिवर्तन की निगरानी करने के लिए इस संवेदनशीलता का लाभ लेने के लिए अनुमति देता है.
परंपरागत जैविक डाई अणुओं का उपयोग करता है जो झल्लाहट, की तुलना में, LRET अतिरिक्त लाभ प्रदान करता है. LRET में, बजाय दाता फ्लोरोफोरे, एक lanthanide श्रृंखला कटियन, आमतौर पर टीबी 3 + या यूरोपीय संघ 3 + के रूप में एक कार्बनिक डाई का उपयोग कर के, 1,4-6 प्रयोग किया जाता है. यू गिर कि fluorophoresnder इस श्रेणी, जैसे, टर्बियम chelate, यह भी कहा कि वे स्वीकर्ता fluorophores की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ प्रयोग किया जा सकता है में बहुत बहुमुखी हैं. Chelated lanthanides का उत्सर्जन स्पेक्ट्रा कई तेज उत्सर्जन चोटियों होते हैं क्योंकि यह लचीलापन स्वीकर्ता fluorophores की एक विस्तृत विविधता का एक साथ इस्तेमाल किया जा दाता फ्लोरोफोरे की एक प्रजाति के लिए अनुमति देता है, संभव बनाया है. इस प्रकार, अवगत स्वीकर्ता उत्सर्जन दाता उत्सर्जन 5 से खून के माध्यम से contaminating के बिना किसी डर पाया जा सकता है. प्रयोगकर्ता दो fluorophores (चित्रा 1 और 1 टेबल) के बीच होने की उम्मीद दूरी के आधार पर विशिष्ट स्वीकर्ता का चयन करता है. इन chelated lanthanide fluorophores में, धातु आयन macromolecule 1 पर एक विशिष्ट कार्यात्मक समूह के लिए आयन तार को एक bioreactive कार्यात्मक समूह के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उत्तेजना के लिए सामान्य रूप से खराब अवशोषित lanthanide sensitizes कि एक एंटीना समूह है जिसमें एक अणु से chelated है, 5,6. ONCउत्साहित ई, lanthanides millisecond रेंज में एक क्षय दर के साथ फोटॉनों की रिहाई के माध्यम से जमीन राज्य के लिए आराम करो. क्षय एक स्वेटर करने वाली स्वेटर छूट न ही एक triplet करने वाली स्वेटर छूट जाता है, क्योंकि फोटॉनों का उत्सर्जन ठीक से प्रतिदीप्ति या स्फुरदीप्ति नहीं कहा जा सकता, लेकिन अधिक ठीक से luminescence 1 करार दिया है. lanthanide luminescence के लंबे क्षय बहुत जीवनकाल माप में मदद करता है. लाइफटाइम माप तो निम्नलिखित संबंध के माध्यम से दक्षता का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है:
Eq. 2
जहां, ई स्थानांतरण की क्षमता है, τ डी ऊर्जा हस्तांतरण में भाग नहीं जब दाता (chelated lanthanide) के जीवनकाल है, और स्वीकर्ता के साथ ऊर्जा हस्तांतरण में भाग लेने जब τ डीए दाता के जीवनकाल है. LRET साथ, τ डीए अल कर सकते हैंटर्बियम के जीवन इतना अधिक से अधिक एक कार्बनिक स्वीकर्ता फ्लोरोफोरे से है क्योंकि इतनी अवगत स्वीकर्ता उत्सर्जन के जीवनकाल के रूप में मापा जाना. स्वीकर्ता अपनी उकसाने उत्तेजना (दाता lanthanide) के रूप में ही जीवन भर के साथ उत्सर्जन करता है, और स्वीकर्ता की अपनी आंतरिक प्रतिदीप्ति जीवनकाल से जीवन भर के लिए कोई योगदान अपेक्षाकृत नगण्य है. स्वीकर्ता को दाता की: 1 के अनुपात बल्कि दाता उत्सर्जन से अवगत उत्सर्जन को मापने के द्वारा, हम भी बिल्कुल एक 1 पर लेबलिंग सुनिश्चित करने की आवश्यकता को समाप्त. प्रोटीन के बजाय स्वीकर्ता और दाता fluorophores दोनों के साथ एक साथ लेबल किया जा सकता. एक विभिन्नतापूर्वक लेबल आबादी परिणाम होगा, लेकिन डबल दाता लेबल प्रोटीन स्वीकर्ता तरंग दैर्ध्य में उत्सर्जन नहीं होगा और डबल स्वीकर्ता लेबल प्रोटीन उत्साहित नहीं होगा. इसके अलावा, fluorophores के बीच की दूरी की परवाह किए बिना एक दाता के रूप में isotropic lanthanides का उपयोग विशेष रूप से जब एक दिया फ्लोरोफोरे, करने के लिए देता है, जो सिस्टीन साइट की, एक ही हो, तो nee चाहिएडी दाता या स्वीकर्ता या तो अनावश्यक है प्राप्त करने के लिए किसी साइट को निर्दिष्ट करने के लिए. तीव्रता एक विषम आबादी के साथ प्रभावित हो सकता है, लेकिन अभी भी पता लगाया जा करने के लिए पर्याप्त से अधिक होना चाहिए.
प्रयोगों की योजना बना, fluorophores के चुनाव जोड़ी के आर 0 मूल्य के साथ ही उम्मीद दूरी रेंज से तय किया जाना चाहिए मापा जा रहा है. आर 0 मान निम्न समीकरण द्वारा परिभाषित किया गया है:
Eq. 3
जहां, आर 0 Angstroms में फोर्स्टर त्रिज्या है, 2 κ (आमतौर पर 2/3 माना) दो रंगों के बीच अभिविन्यास कारक है, φ डी दाता की मात्रा उपज है, जम्मू दाता के बीच अभिन्न वर्णक्रमीय ओवरलैप है एम में उत्सर्जन स्पेक्ट्रम और स्वीकर्ता के absorbance स्पेक्ट्रम – 1सेमी -1 एनएम 4, और एन मध्यम 1 का अपवर्तनांक है.
हमारी प्रयोगशाला की जांच की जा रही प्रोटीन पर दाता और स्वीकर्ता लेबल साइटों के बीच एक प्रोटीज मान्यता साइट शुरू करने से पारंपरिक LRET तकनीक के लिए एक संशोधन जोड़ा गया है. यह संशोधन ऐसे पूरे स्तनधारी कोशिकाओं के रूप में 7 गैर शुद्ध सिस्टम में जांच के लिए अनुमति देता है. Cysteines भी चिह्नित कर रहे है कि कोशिकाओं पर सिस्टीन sulfhydryl समूहों, अन्य प्रोटीन के लिए बाध्य है कि maleimide संयुग्मित रंगों के साथ लेबलिंग की प्रक्रिया में है, क्योंकि लेबलिंग के लिए साइटों के रूप में cysteines का उपयोग करते समय इस तकनीक को विशेष रूप से उपयोगी है. हालांकि, ब्याज की प्रोटीन पर प्रोटीज दरार साइटों सहित और पहले और दरार के बाद जन्मों को मापने के द्वारा, प्रयोगकर्ता मात्रात्मक कच्चे संकेत से प्रोटीज दरार के बाद पृष्ठभूमि संकेत घटाना कर सकते हैं. इस घटाव (छवि ब्याज की प्रोटीन से उत्पन्न होने वाली विशिष्ट संकेत आइसोलेट्सure 2). ऊपर वर्णित संशोधन का प्रयोग, LRET टर्बियम chelate दाता और एक प्रोटीन पर स्वीकर्ता जांच के बीच दूरी बदलाव को मापने, और इस प्रकार शोधन के लिए आवश्यकता के बिना प्रोटीन के पास शारीरिक स्थिति में गठनात्मक परिवर्तन की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
चित्रा 1.The अवशोषण और काले रंग में chelated टर्बियम, साथ ही लाल रंग में एक प्रतिनिधि स्वीकर्ता, एलेक्सा 488, के उत्सर्जन स्पेक्ट्रा. कई उत्सर्जन चोटियों और टर्बियम chelate की प्रत्येक चोटी के लिए तेज, संकीर्ण उत्सर्जन सीमा पर ध्यान दें. यह पैटर्न टर्बियम स्वीकर्ता fluorophores की एक किस्म के साथ प्रयोग किया जा करने के लिए अनुमति देता है और टर्बियम कोई उत्सर्जन से पता चलता है जहां उन सीमाओं के भीतर अवगत उत्सर्जन की माप की सुविधा. एक साथ बहुत अच्छी तरह से ओवरलैप एनएम 486 पर टर्बियम के उत्सर्जन शिखर दो fluorophores के बीच होने की प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण के लिए अनुमति एलेक्सा 488 के bsorption शिखर,. 515 एनएम के तरंग दैर्ध्य यह टर्बियम उत्सर्जन चोटियों के बीच घाटी में है, और काफी 520 एनएम का एलेक्सा 488 के उत्सर्जन चोटी के पास के रूप में इस जोड़ी के लिए अवगत उत्सर्जन का पता लगाने के लिए एक शानदार विकल्प है. स्वीकर्ता चोटी के पास जा रहा है, वांछनीय है, हालांकि नहीं है आवश्यक-565 एनएम अभी भी टर्बियम उत्सर्जन का पता लगाने के बिना एलेक्सा 488 उत्सर्जन का पता लगाने में सक्षम है कि ध्यान दें.
| अपनाने Fluorophore | आर 0 (क) | उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य (एनएम) |
| ATTO 465 | 36 | 3px, "> 508|
| Fluorescein | 45 | 515 |
| एलेक्सा 488 | 46 | 515 |
| एलेक्सा 680 | 52 | 700 |
| एलेक्सा 594 | 53 | 630 |
| एलेक्सा 555 | 65 | 565 | Cy3 | 65 | 575 |
तालिका 1 LRET दाता के रूप में 11 टर्बियम chelate प्रयोग करने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया स्वीकर्ता fluorophores की एक सूची. दाता और स्वीकर्ता AMPA रिसेप्टर्स के घुलनशील एगोनिस्ट बाध्यकारी डोमेन से जुड़े थे जब आर 0 मूल्यों मापा गया. यह हर नई प्रणाली का अध्ययन किया जा रहा है के लिए फिर से आर 0 मूल्य को मापने के लिए आदर्श है.
चित्रा 2 प्रस्तुत LRET विधि का अवलोकन. (ए) AMPA रिसेप्टर ligand बाध्यकारी पर गठनात्मक परिवर्तन आए जो एक झिल्ली प्रोटीन है. सीपी के आकार ligand बीआईnding डोमेन लाल में यहां की परिक्रमा कर रहा है. (बी) प्रोटीन के लिए बाध्य नहीं है जब AMPA की ligand बाध्यकारी डोमेन एक खुली रचना (बाएं) में मौजूद है. ग्लूटामेट ligand करने के लिए बाध्य करते हैं, तो प्रोटीन अपने ligand (दाएं) के आसपास बंद कर देता है. LBD पर प्रमाण स्थलों पर fluorophores रखने से, इस गठनात्मक परिवर्तन की प्रकृति तो प्रतिदीप्ति जीवनकाल को प्रभावित करेगा जो fluorophores परिवर्तन, के बीच की दूरी के रूप में देखा जा सकता है. (सी) लेबलिंग पूरे कोशिकाओं, ब्याज की प्रोटीन के साथ ही पृष्ठभूमि झिल्ली प्रोटीन दोनों की लेबलिंग (बाएं) हो सकता है. प्रोटीज दरार के बाद, ब्याज की प्रोटीन से LRET संकेत पृष्ठभूमि संकेत बरकरार (दाएं) छोड़ने की वजह से एक घुलनशील टुकड़ा की रिहाई के लिए गायब हो जाएगा. इस पृष्ठभूमि संकेत तो कच्चे संकेत से घटाया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
LRET वैज्ञानिकों ने एक ही प्रोटीन के भीतर और साथ ही एक multimeric प्रोटीन में सब यूनिटों के बीच डोमेन के बीच दूरी को मापने के लिए अनुमति देता है कि एक शक्तिशाली तकनीक है. जैसे, LRET प्रोटीन या अन्य अणुओं के गठनात्मक प…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के स्वास्थ्य अनुदान GM094246, अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन अनुदान 11GRNT7890004, और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान एमसीबी-1110501 के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| LanthaScreen Thiol Reactive Tb Chelate | Life Technologies | PV3579 | |
| Acceptor fluorophore-Fluorescein-5-Maleimide | Life Technologies | F-150 | Choice of acceptor depends on the specific experiment |
| Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 488 C5 Maleimide | Life Technologies | A-10254 | Choice of acceptor depends on the specific experiment |
| Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 555 C2 Maleimide | Life Technologies | A-20346 | Choice of acceptor depends on the specific experiment |
| Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 594 C5 Maleimide | Life Technologies | A-10256 | Choice of acceptor depends on the specific experiment |
| Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 680 C2 Maleimide | Life Technologies | A-20344 | Choice of acceptor depends on the specific experiment |
| QuantaMaster 3-SS | Photon Technology International | Spectrofluorometer should have pulsed excitation with the ability to measure lifetimes in the ms range | |
| FluoreScan 2.0 | Photon Technology International | Data Acquisition Software used in manuscript. Software provided with fluorescence instrument. | |
| Origin 8.6 | OriginLab | Origin is the data analysis software used in protocol. Can use other similar data analysis software | |
| Quartz Cuvette | Starna Cells, Inc | 3-Q-10 | |
| Stir Bar | Bel-Art Products | F37119-0007 | Used in cuvette to keep cells in suspension. Can use any stir bar that fits the cuvette |
Riferimenti
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