Luminescence Resonance Energy Transfer allo Studio conformazionale Cambiamenti nella membrana proteine ​​espresse in cellule di mammifero

Summary

Descriviamo qui un metodo migliorato di trasferimento Luminescence Resonance Energy (lRet) dove introduciamo un sito proteasi scissione tra i siti fluoroforo donatore e accettore. Questa modifica ci permette di ottenere segnali lRet specifici derivanti dalle proteine ​​di membrana di interesse, consentendo lo studio di proteine ​​di membrana, senza purificazione della proteina.

Abstract

Trasferimento Luminescence Resonance Energy, o lRet, è una potente tecnica utilizzata per misurare le distanze tra due siti nelle proteine ​​all'interno della gamma distanza di 10-100 Å. Misurando le distanze in diverse condizioni legatura, cambiamenti conformazionali della proteina possono essere facilmente valutati. Con lRet, un lantanidi, terbio il più delle volte chelato, è utilizzato come fluoroforo donatore, offrendo vantaggi quali una maggiore durata unico donatore-emissione, la flessibilità di utilizzare più fluorofori accettore, e la possibilità di rilevare le emissioni accettore sensibilizzata come un modo semplice misurare trasferimento di energia senza il rischio di rilevare anche solo segnali donatori. Qui, descriviamo un metodo per utilizzare lRet sulle proteine ​​di membrana espresse e testati sulla superficie delle cellule di mammifero intatte. Introduciamo un sito proteasi scissione tra la coppia fluoroforo lRet. Dopo aver ottenuto il segnale lRet originale, scissione in quel sito rimuove il segnale lRet specifica proteina diinteresse che ci permette di sottrarre quantitativamente il segnale di fondo che rimane dopo la scissione. Questo metodo consente una più fisiologicamente rilevanti misurazioni da effettuare, senza la necessità di purificazione di proteine.

Introduction

Trasferimento Luminescence Resonance Energy (lRet) è un derivato del ben noto Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) tecnica ^1. Simile a preoccuparsi, lRet può essere utilizzato per misurare le distanze e le variazioni di distanza tra fluorofori donatore e accettore collegati a siti specifici sulla proteina di interesse all'interno della gamma di 10-100 Å ^1-3. I principi della lRet sono simili a FRET dal fatto che il trasferimento di energia di risonanza si verifica tra due fluorofori prossimali quando lo spettro di emissione del fluoroforo donatore si sovrappone con lo spettro di assorbimento del fluoroforo accettore. L'efficienza di questo trasferimento è correlata alla distanza tra i due fluorofori dalla seguente equazione:

Eq. 1

dove R è la distanza tra i due fluorofori, E è l'efficienza di entrasferimento ERGIA, e R _0, discusso in seguito, è il raggio Förster per la coppia fluoroforo, cioè la distanza alla quale l'efficienza di trasferimento è a metà-massimale. Da questa equazione, si può vedere che l'efficienza è legata alla grandezza della distanza elevato alla sesta potenza inversa ^1. E 'questo inversa sesto dipendenza potenza che permette di FRET e misurazioni lRet essere squisitamente sensibile anche a piccole variazioni di distanza, quando nei pressi della R ₀ della coppia FRET. La capacità di etichettare specificamente i siti desiderati sulle proteine ​​o altre macromolecole permette di approfittare di questa sensibilità per monitorare i cambiamenti conformazionali.

Rispetto al FRET, che utilizza molecole di colorante organiche convenzionali, lRet offre ulteriori vantaggi. In lRet, invece di utilizzare un colorante organico come fluoroforo donatore, un catione serie dei lantanidi, tipicamente Tb ³⁺ o Eu ^{3 +,} viene utilizzato ^1,4-6. Fluorofori che cadono uTEDS questa categoria, per esempio, terbio chelato, sono anche molto versatile in quanto possono essere utilizzati con una vasta gamma di fluorofori accettori. Tale flessibilità è possibile perché gli spettri di emissione dei lantanidi chelati contenere più picchi di emissione taglienti, consentendo una singola specie di fluoroforo donatore per essere utilizzato con uno di una vasta gamma di fluorofori accettori. Così, emissione accettore sensibilizzati può essere rilevato senza alcun timore di contaminare sanguinare-through da emissioni donatore ^5. Lo sperimentatore seleziona il accettore specifico in base alla distanza prevista tra i due fluorofori (Figura 1 e Tabella 1). In questi fluorofori lantanidi chelati, lo ione metallico è chelato da una molecola contenente un gruppo antenna che sensibilizza il lantanide normalmente scarsamente assorbente all'eccitazione e un gruppo funzionale bioreactive per legare lo ione di un gruppo funzionale specifico sulla macromolecola ^{1, 5,6.} Once eccitato, lantanidi rilassarsi allo stato fondamentale mediante il rilascio di fotoni, con un tasso di decadimento dell'ordine del millisecondo. Poiché il decadimento è né un rilassamento singoletto a singoletto né un rilassamento tripletto a singoletto, l'emissione di fotoni può non essere correttamente chiamato fluorescenza o fosforescenza, ma è più propriamente definito luminescenza ^1. La lunga decadenza di lantanidi luminescenza aiuta molto nelle misurazioni a vita. Misurazioni Lifetime possono quindi essere utilizzati per determinare l'efficienza tramite la seguente relazione:

Eq. 2

dove E è l'efficienza del trasferimento, τ _D è la durata del donatore (lantanidi chelato) quando non partecipano al trasferimento di energia, e τ _DA è la durata del donatore quando partecipano a trasferimento di energia con l'accettore. Con lRet, τ _DA possibile alin modo da misurare la durata dell'emissione accettore sensibilizzata perché la vita di terbio è tanto più grande di un fluoroforo accettore organico. L'accettore emette con la stessa vita come la sua eccitazione incitamento (lantanidi donatore), e qualsiasi contributo per la durata di vita propria fluorescenza intrinseca del accettore è relativamente trascurabile. Misurando l'emissione sensibilizzata piuttosto che di emissione del donatore, abbiamo anche eliminare la necessità di garantire un'etichettatura esattamente un rapporto 1: 1 di donatore accettore. Proteina può invece essere etichettato contemporaneamente sia con accettatore e fluorofori donatori. Una popolazione eterogenea etichetta si tradurrà, ma proteine ​​marcate doppio donatore non emette nella lunghezza d'onda accettore e proteine ​​marcate doppio-accettore non sarà entusiasta. Inoltre, la distanza tra i fluorofori dovrebbe essere lo stesso, a prescindere da quale cisteina sito un determinato fluoroforo attribuisce a, soprattutto quando si utilizzano i lantanidi isotropi come un donatore, in modo che il need per specificare un determinato sito per ricevere il donatore o accettore non è necessaria. L'intensità può essere affetto da una popolazione eterogenea, ma dovrebbe comunque essere più che sufficiente per essere rilevato.

Nel progettare esperimenti, la scelta di fluorofori dovrebbe essere dettata dal valore R ₀ della coppia nonché nell'intervallo previsto distanza da misurare. Il valore R ₀ è definito dalla seguente equazione:

Eq. 3

dove R ₀ è il raggio Förster in Angstrom, κ ² è il fattore di orientamento tra i due coloranti (di solito assunti per essere 2/3), φ _D è la resa quantica del donatore, J è la sovrapposizione spettrale integrale tra il donatore del spettro di emissione e lo spettro di assorbimento del accettore in M ^{– 1}cm ^-1 nm ^4, ed n è l'indice di rifrazione del mezzo ^1.

Il nostro laboratorio ha aggiunto una modifica alla tecnica convenzionale lRet introducendo un sito di riconoscimento proteasi tra donatore e accettore siti etichette sulla proteina essendo sondato. Questa modifica permette di indagine in sistemi non-purificato come le cellule di mammifero intere ^7. Questa tecnica è particolarmente utile quando si utilizzano cisteine ​​come siti per l'etichettatura, poiché nel processo di etichettatura con coloranti maleimmide coniugato che si legano ai gruppi sulfidrilici cisteina, altre proteine ​​sulle cellule che hanno cisteine ​​sono inoltre classificati. Tuttavia, includendo i siti di clivaggio della proteasi sulla proteina di interesse e vite di misura prima e dopo clivaggio, lo sperimentatore può quantitativamente sottrarre il segnale di fondo dopo proteasi scissione dal segnale grezzo. Questa sottrazione isola il segnale specifico derivante dalla proteina di interesse (FigURE 2). Utilizzando la modifica sopra descritta, lRet può essere utilizzato per misurare le variazioni di distanza tra il donatore terbio chelato e la sonda accettore su una proteina, e quindi monitorare i cambiamenti conformazionali stato fisiologico prossimità della proteina senza la necessità di purificazione.

Figura 1.L spettri di assorbimento e di emissione di terbio chelato in nero, così come un accettore rappresentante, Alexa 488, in rosso. Notare i picchi di emissione più e il forte, intervallo di emissione stretto per ogni picco di terbio chelato. Questo modello permette di terbio di essere utilizzato con una varietà di fluorofori accettori e facilita la misurazione delle emissioni sensibilizzati all'interno di tali intervalli in cui terbio mostra nessuna emissione. Picco di emissione di terbio a 486 nm si sovrappone abbastanza bene con l'una picco bsorption di Alexa 488, consentendo il trasferimento di energia di risonanza a verificarsi tra i due fluorofori. Lunghezza d'onda di 515 nm è una scelta eccellente per rilevare le emissioni sensibilizzati per questa coppia, come è nella valle tra i picchi di emissione terbio, e abbastanza vicino picco di Alexa 488 di emissione di 520 nm. Si noti che essendo vicino al picco accettore, anche se auspicabile, non è necessaria-565 nm è ancora in grado di rilevare Alexa 488 emissione senza anche rilevare emissione terbio.

3px; "> 508 <trheight = "22">

Fluoroforo accettore	R 0 (Å)	Emissione lunghezza d'onda (nm)
Atto 465	36
Fluoresceina	45	515
Alexa 488	46	515
Alexa 680	52	700
Alexa 594	53	630
Alexa 555	65	565
Cy3	65	575

Tabella 1 Un elenco di fluorofori accettori comunemente usati per lRet utilizzo terbio chelato come il donatore ^11. I R ₀ valori sono stati misurati quando il donatore e accettore sono state allegate alla agonista dominio di legame solubili dei recettori AMPA. E 'ideale per misurare nuovamente il valore di R ₀ per ogni nuovo sistema in fase di studio.

Figura 2 Una panoramica del metodo lRet presentato. (A) Il recettore AMPA è una proteina di membrana che subisce cambiamenti conformazionali upon-ligando. Il ligando-bi-a forma di conchiglianding dominio è cerchiata in rosso qui. (B) Il dominio ligand-legame di AMPA quando non si lega alle proteine ​​esiste in una conformazione aperta (a sinistra). Quando è legato al ligand glutammato, la proteina chiude attorno al suo ligando (a destra). Inserendo fluorofori in siti probatori sul LBD, la natura di questo cambiamento conformazionale può essere visto come la distanza tra i fluorofori modifiche, che poi incidere durata della fluorescenza. (C) Quando etichettatura cellule intere, l'etichettatura sia della proteina di interesse così come le proteine ​​di membrana sfondo si possono verificare (a sinistra). Dopo proteasi clivaggio, segnale lRet dalla proteina di interesse scomparirà a causa del rilascio di un frammento solubile, lasciando intatto sfondo segnale (a destra). Questo segnale di fondo può essere sottratto dal segnale grezzo.

Protocol

1 Creare il Construct contenente la proteina di interesse Clonazione del gene che esprime la proteina di interesse in un vettore adatto. Utilizzare i vettori come la serie pcDNA o pRK5 in quanto sono adatti per l'espressione in sistemi di mammiferi come le cellule HEK293 e CHO. 2. selezionare i siti sulla proteina per essere etichettate con fluorofori Scegliere siti di etichettatura che sono in grado di riflettere eventuali cambiamenti conformazional…

Representative Results

Una misurazione lRet successo con un donatore lantanide dovrebbe avere un donatore solo vita nell'intervallo di tempo millisecondi. La durata di emissione lRet sensibilizzati per la proteina marcata con sia il donatore e l'accettore sarà notevolmente più breve, con una durata nel range microsecondo dopo sottrazione del fondo Figura 3. Proteasi risultati scissione in un aumento della vita che dovrebbe diventare stabile nel tempo ( cioè cambiando non più), mostrando che la scissione d…

Discussion

LRet è una potente tecnica che permette agli scienziati di misurare le distanze tra i domini all'interno di una singola proteina, come pure tra subunità di una proteina multimerica. Come tale, lRet è adatto a esaminare i cambiamenti conformazionali e dinamiche di proteine ​​o altre macromolecole. Il protocollo di cui sopra dovrebbe consentire il laboratorio adeguatamente attrezzato per testare facilmente le loro ipotesi; tuttavia, ci sono molte fonti comuni di errore che possono affliggere il nuovo investigat…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
LanthaScreen Thiol Reactive Tb Chelate	Life Technologies	PV3579
Acceptor fluorophore-Fluorescein-5-Maleimide	Life Technologies	F-150	Choice of acceptor depends on the specific experiment
Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 488 C5 Maleimide	Life Technologies	A-10254	Choice of acceptor depends on the specific experiment
Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 555 C2 Maleimide	Life Technologies	A-20346	Choice of acceptor depends on the specific experiment
Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 594 C5 Maleimide	Life Technologies	A-10256	Choice of acceptor depends on the specific experiment
Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 680 C2 Maleimide	Life Technologies	A-20344	Choice of acceptor depends on the specific experiment
QuantaMaster 3-SS	Photon Technology International		Spectrofluorometer should have pulsed excitation with the ability to measure lifetimes in the ms range
FluoreScan 2.0	Photon Technology International		Data Acquisition Software used in manuscript. Software provided with fluorescence instrument.
Origin 8.6	OriginLab		Origin is the data analysis software used in protocol. Can use other similar data analysis software
Quartz Cuvette	Starna Cells, Inc	3-Q-10
Stir Bar	Bel-Art Products	F37119-0007	Used in cuvette to keep cells in suspension. Can use any stir bar that fits the cuvette