The expression of recombinant proteins by mammalian systems is becoming an attractive method for producing protein complexes for structural biology. Here we present a simple yet highly efficient expression system using suspension grown mammalian cells to purify protein complexes for structural studies.
The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two decades, prokaryotic expression systems such as E. coli have dominated the scientific literature over costly and less efficient eukaryotic cell lines. Despite the clear advantage in terms of yields and costs of expressing recombinant proteins in bacteria, the absence of specific co-factors, chaperones and post-translational modifications may cause loss of function, mis-folding and can disrupt protein-protein interactions of certain eukaryotic multi-subunit complexes, surface receptors and secreted proteins. The use of mammalian cell expression systems can address these drawbacks since they provide a eukaryotic expression environment. However, low protein yields and high costs of such methods have until recently limited their use for structural biology. Here we describe a simple and accessible method for expressing and purifying milligram quantities of protein by performing transient transfections of suspension grown HEK (Human Embryonic Kidney) 293F cells.
आणविक कोशिका जीव विज्ञान के तेजी से प्रगति और चिकित्सा में सुधार दवाओं के लिए लगातार जरूरत संरचनात्मक जीव तेजी से और अधिक जटिल प्रोटीन संरचनाओं को देखने के लिए एक जरूरत बन गया है. ये अक्सर अपने विस्तृत तह और enzymatic गतिविधि का समर्थन करने के लिए विशेष बाद translational संशोधनों, आणविक संरक्षिकाओं और सह कारकों की आवश्यकता होती है सकते हैं. बैक्टीरियल अभिव्यक्ति सिस्टम का उपयोग कर प्राप्त किया गया है प्रोटीन डाटा बैंक में मौजूद संरचनाओं के विशाल बहुमत Whilst, प्रोकीर्योट्स इन संशोधनों की एक बड़ी संख्या में प्रदर्शन करने में असमर्थ हैं और कई आवश्यक यूकेरियोटिक सह कारकों की कमी है. इस छोटे संकेतन अणुओं से और साथ ही परमाणु, कोशिका की सतह और विस्तृत तह मशीनरी की आवश्यकता है कि स्रावित प्रोटीन के लिए सक्रिय कर रहे हैं कि बड़ी बहु सबयूनिट परिसरों के अध्ययन के लिए एक मुद्दा हो सकता है. ई की संख्या कोलाई उपभेदों इन सीमाओं 1 से कुछ दूर करने के लिए इंजीनियर किया गया है. एम के हाल के वर्षों में, हालांकि, प्रयोगवे मज़बूती से अन्य प्रणालियों 2 में व्यक्त करने के लिए अन्यथा समस्याग्रस्त हैं कि यूकेरियोटिक प्रोटीन का उत्पादन क्योंकि ammalian अभिव्यक्ति प्रणालियों बढ़ रही है. आज यह रासायनिक मध्यस्थता अभिकर्मक को वायरल पारगमन से लेकर है कि तकनीक की एक किस्म के माध्यम से स्थिर और क्षणिक स्तनधारी अभिव्यक्ति सेल लाइनों प्राप्त करने के लिए संभव है, ऐसे electroporation और प्रत्यक्ष इंजेक्शन के रूप में 3 भौतिक जीन स्थानांतरण. इन तरीकों के सभी फायदे और नुकसान का अपना स्थापित किया है, उनमें से केवल कुछ या तो बहुत महंगा है और / या समय लेने जा रहा संरचनात्मक अध्ययन के लिए उपयुक्त हैं.
यहाँ हम निलंबन हो गई स्तनधारी कोशिकाओं में संरचनात्मक जीव विज्ञान के लिए प्रोटीन परिसरों व्यक्त करने के लिए एक बहुत ही सरल, तेज, सस्ती अभी तक अत्यधिक कुशल विधि का वर्णन. दृष्टिकोण (जैसे, फ्रीस्टाइल HEK 293F कोशिकाओं) एक मानव भ्रूण गुर्दे (HEK) सेल लाइन की क्षणिक सह अभिकर्मक का उपयोग करता है. इन कोशिकाओं को HEK 293 CE से प्राप्त किया गया हैटू लाइन, सीरम मुक्त मीडिया का उपयोग उच्च घनत्व (जैसे फ्रीस्टाइल 293 अभिव्यक्ति के माध्यम के रूप) तक पहुंच गया, निलंबन संस्कृतियों में विकसित करने के लिए अनुकूलित कर रहे हैं. कोशिकाओं तो क्षणिक polyethylenimine की एक branched संस्करण (पी), endocytosis 5 से मेजबान कोशिका में प्रवेश कि डीएनए / पी परिसरों के गठन से स्तनधारी कोशिकाओं 4 की एक बड़ी रेंज के लिए कार्य करने के लिए सूचित किया गया है कि एक सस्ती बहुलक अभिकर्मक का उपयोग ट्रांसफ़ेक्ट हैं. यह विधि छोटे पैमाने (30 एमएल) और (300 मिलीलीटर तक) बड़े पैमाने पर दोनों के लिए उपयुक्त प्रयोगों है और शुद्ध प्रोटीन परिसरों का उच्च स्तर का उत्पादन कर सकते हैं. यह जटिल तह मशीनरी, सह कारकों या बैक्टीरिया, खमीर और कीट कोशिकाओं द्वारा नहीं किया जा सकता कि विशेष बाद translational संशोधनों की आवश्यकता है कि प्रोटीन के अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयोगी है.
इस प्रोटोकॉल में हम Sin3A ट्रांसक्रिप्शनल दमन परिसर से तीन प्रोटीन केंद्रीय पाड़ की अभिव्यक्ति और शुद्धि प्रस्तुत करते हैं. इस Histone के होते हैंDeacetylase 1 (HDAC1), दोषपूर्ण मुंह बंद 3 (SDS3) का शमन और स्विच स्वतंत्र 3 (Sin3A). शुद्ध जटिल उच्च throughput क्रिस्टलीकरण परीक्षण के लिए प्रयोग किया जाता है.
हम व्यक्त और पुनः संयोजक प्रोटीन और स्तनधारी कोशिकाओं से बहु सबयूनिट परिसरों की बड़ी मात्रा में शुद्ध के लिए (पी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध lipophilic अभिकर्मक अभिकर्मकों की तुलना में बहुत कम लागत) एक सरल और लागत प्रभावी तरीका विकसित किया है. प्रोटोकॉल खंड में वर्णित के रूप में अत्यधिक शुद्ध प्लाज्मिड डीएनए (260/280 1.8 के बीच और 2.0) पी के साथ संयोजन में उपयोग किया जाता है, तो इष्टतम अभिकर्मक और अभिव्यक्ति दक्षता पहुंचा जा सकता है. प्रकोष्ठों serum- और एंटीबायोटिक मुक्त मीडिया में सुसंस्कृत होना चाहिए, इसलिए, बाँझ तकनीक सख्ती से महंगा है और समय लेने वाली संक्रमण से बचने के लिए Passaging और transfecting कोशिकाओं के लिए आवश्यक है. सेल व्यवहार्यता 90% या अधिक होना चाहिए और संस्कृतियों 2.5 x 10 6 कोशिकाओं की तुलना में अधिक से अधिक घनत्व के लिए विकसित किया जा नहीं करना चाहिए / तुरंत एक अभिकर्मक से पहले ऐसा करने के रूप में प्रोटीन उपज कम हो जाएगा एमएल. एक सफल अभिकर्मक के लिए, संस्कृतियों केवल एक या विभाजित कोशिकाओं को शामिल करना चाहिए. क्लस्टर ताक़त से टूट किया जा सकता है30 सेकंड (चित्रा 5) को ous vortexing 20. सह अभिकर्मक में इस्तेमाल प्रत्येक प्लाज्मिड के अनुपात का अध्ययन जटिल होने का stoichiometry के अनुसार उपयोगकर्ता द्वारा अलग किया जा सकता है. एक उपयुक्त अभिव्यक्ति समय स्थापित किया जा सकता है कि इतनी अभिव्यक्ति दक्षता, ब्याज की प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. शुद्धीकरण अवांछित proteolytic गिरावट के जोखिम को कम करने के लिए हर समय प्रोटीन नमूना ठंडा रखने प्रदर्शन किया जाना चाहिए. वे अक्सर कम विलेयता और / या enzymatic गतिविधि के नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप, संरचनात्मक तत्वों या कुछ प्रोटीन की सक्रिय साइटों के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं के बाद से टैग और शुद्धि बफ़र्स के चुनाव महत्वपूर्ण है. छोटे पैमाने transfections बड़े प्रोटीन परिसरों की शुद्धि के लिए विभिन्न निर्माणों के परीक्षण के लिए विशेष रूप से उपयोगी हैं.
आज, वैकल्पिक तरीकों की एक विशाल विविधता पुनः संयोजक यूकेरियोटिक प्रोटीन (तालिका 2) की अभिव्यक्ति के लिए उपलब्ध हैं. उदाहरण के लिए, Baculoviकीट कोशिकाओं में रस अभिव्यक्ति व्यापक रूप से अपने उच्च पारगमन दक्षता और अन्य वायरल प्रजातियों 6 की तुलना में cytotoxicity की कमी की वजह से किया जाता है. हालांकि, वायरस बनाने की प्रक्रिया समय लेने वाली है और इसके अस्थिरता वायरस लंबी अवधि के लिए जमा होने की अनुमति नहीं है. दूसरी ओर, खमीर अभिव्यक्ति प्रणालियों उच्च प्रोटीन पैदावार 7, जिसके परिणामस्वरूप किण्वक संस्कृतियों में कोशिकाओं को बहुत उच्च घनत्व बढ़ रही है की संभावना प्रदान करते हैं. लेकिन वे अभी भी सही ढंग से गुना और उनके प्रोटीन सहयोगियों के साथ बातचीत करने के लिए यूकेरियोटिक प्रोटीन के लिए आवश्यक बाद translational संशोधनों की पूरी विविधता की कमी है. HDAC3, उदाहरण के लिए, व्यक्त की है लेकिन ई में गुना नहीं करता कोलाई. 293F कोशिकाओं में व्यक्त हालांकि, जब हम अपने सह repressor (SMRT) और प्रोकार्योटिक कोशिकाओं में नहीं पाया जाता है जो inositol tetraphosphate (IP4) 8, की एक अणु के साथ परिसर में एक सक्रिय एंजाइम को शुद्ध करने में सक्षम थे. इस विधि को भी सेंट शुद्ध और क्रिस्टल को हल करने के लिए हमें अनुमति दी गई हैHDAC1 इसी प्रकार IP4 9 से सक्रिय है जो NuRD परिसर में MTA1 के साथ बातचीत की ructure. आदर्श रूप में, हम हमेशा अपने प्राकृतिक, शारीरिक वातावरण में यूकेरियोटिक प्रोटीन व्यक्त करना चाहते हैं. बायोरिएक्टर 10-12 में HEK 293-EBNA1 कोशिकाओं को रोजगार स्तनधारी अभिव्यक्ति प्रणाली वर्णित और प्रोटीन के बहुत उच्च स्तर की उपज है, लेकिन इन उपयोग करने के लिए जटिल हो सकता है किया गया है.
हमारे विधि बैक्टीरिया, खमीर और बायोरिएक्टर प्रणाली में अभिव्यक्ति के लिए एक सरल और सुलभ विकल्प है. अभिव्यक्ति विधि तेज है और रोलर बोतल या कुप्पी माहौल 5% सीओ 2 और मानक मिलाते इन्क्यूबेटरों उपयोग किया जाता है के साथ बदल रहा है, खासकर अगर महंगे उपकरण के उपयोग की आवश्यकता नहीं है. हम कई plasmids-transfect सीओ और संस्कृति के> 1 मिलीग्राम / एल की पैदावार के साथ अप करने के लिए पांच प्रोटीन के साथ परिसरों को शुद्ध करने के लिए इन प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है. दिलचस्प बात यह प्रणाली स्थिर अच्छी तरह से व्यवहार परिसरों की पहचान में मदद करता है. उदाहरण के लिए, पूर्व सैनिकों के लिएHDAC1 और Sin3A की बाइनरी जटिल की अभिव्यक्ति प्रोटीन की सीमित पैदावार दे दी है, अभी तक SDS3 के अलावा अधिक मात्रा 5 गुना और इसलिए उपयुक्त निर्माणों और क्रिस्टलीकरण के लिए स्थिर परिसरों के चुनाव में संरचनात्मक जीवविज्ञानी गाइड हुई.
The authors have nothing to disclose.
हम यह काम और लीसेस्टर कोर जैव प्रौद्योगिकी सेवा के विश्वविद्यालय के लिए इस्तेमाल अभिव्यक्ति निर्माणों की तैयारी के लिए डॉ Xiaowen यांग (PROTEX क्लोनिंग सेवा) को धन्यवाद देना चाहूंगा. यह काम एक बीबीएसआरसी छात्रावस्था द्वारा समर्थित किया गया था, वेलकम ट्रस्ट कार्यक्रम और वरिष्ठ अन्वेषक अनुदान WT085408 और WT100237 और बीबीएसआरसी RM31G0224 अनुदान.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
FreeStyle HEK 293F cells | LifeTechnologies | R790-07 | |
FreeStyle 293 Expression Medium | LifeTechnologies | 12338-018 | |
Anti-FLAG M2 Affinity Gel | SIGMA | A220 | |
250 ml Erlenmeyer Flask with Vented Cap | Corning | 431144 | |
Roller bottles with vented caps | Corning | 01836-02 | |
Polyethylinamine, 25 kDa, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | Make 0.5 mg/ml stocks in H2O, adjust pH to 7.0 with dilute HCl and store at -20 – 4ºC |
Mammalian expression vector | – | – | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
0.22 µm Centrifugal Filter Units | Amicon | UFC30GV00 | |
15 ml Ultra centrifugal filters (10 kDa cut-off) | Amicon | UFC901008 | |
Superdex 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17-5175-01 |