The expression of recombinant proteins by mammalian systems is becoming an attractive method for producing protein complexes for structural biology. Here we present a simple yet highly efficient expression system using suspension grown mammalian cells to purify protein complexes for structural studies.
The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two decades, prokaryotic expression systems such as E. coli have dominated the scientific literature over costly and less efficient eukaryotic cell lines. Despite the clear advantage in terms of yields and costs of expressing recombinant proteins in bacteria, the absence of specific co-factors, chaperones and post-translational modifications may cause loss of function, mis-folding and can disrupt protein-protein interactions of certain eukaryotic multi-subunit complexes, surface receptors and secreted proteins. The use of mammalian cell expression systems can address these drawbacks since they provide a eukaryotic expression environment. However, low protein yields and high costs of such methods have until recently limited their use for structural biology. Here we describe a simple and accessible method for expressing and purifying milligram quantities of protein by performing transient transfections of suspension grown HEK (Human Embryonic Kidney) 293F cells.
Den snabba utvecklingen av molekylär cellbiologi och det ständiga behovet av förbättrade läkemedel inom medicin har skapat ett behov av strukturella biologer att titta på allt mer komplexa proteinstrukturer. Dessa kan ofta kräver särskilda post-translationella modifieringar, molekylära chaperoner och co-faktorer för att stödja deras arbetade vikning och enzymatisk aktivitet. Medan den stora majoriteten av strukturer som finns i Protein Data Bank har erhållits med hjälp av bakteriella expressionssystem, prokaryoter inte kan utföra ett stort antal av dessa ändringar och saknar många viktiga eukaryota co-faktorer. Detta kan vara ett problem för studiet av stora multi subenhet komplex som aktiveras av små signalmolekyler och för nukleär, cellytan och utsöndrade proteiner som kräver genomarbetade fällbara maskinerier. Ett antal E. coli-stammar har utvecklats för att övervinna några av dessa begränsningar 1. Under senare år har emellertid användning av mammalian expressionssystem har ökat eftersom de tillförlitligt producerar eukaryota proteiner som annars problematiskt att uttrycka i andra system 2. Idag är det möjligt att erhålla stabila och övergående däggdjursuttryckscellinjer genom olika tekniker som sträcker sig från viral transduktion till kemisk-medierad transfektion, fysisk genöverföring såsom elektroporering och direktinsprutning 3. Även om alla dessa metoder har sin egen uppsättning av fördelar och nackdelar, bara ett fåtal av dem är lämpliga för strukturstudier vara antingen för dyra och / eller tidskrävande.
Här beskriver vi en mycket enkel, snabb, billig men mycket effektiv metod för att uttrycka proteinkomplex för strukturbiologi i suspensions odlas däggdjursceller. Det tillvägagångssätt använder transient samtransfektion av en human embryonal njure (HEK) cellinje (t.ex. Frisim HEK 293F-celler). Dessa celler har härletts från HEK 293 cell linje, är anpassade att växa i suspensionskulturer, når höga densiteter med användning serumfritt medium (såsom FreeStyle 293 Expression medium). Celler sedan transient med hjälp av en förgrenad version av polyetylenimin (PEI), en billig polymera reagens som har rapporterats fungera för ett stort utbud av däggdjursceller 4 genom att bilda DNA / PEI-komplex som kommer in i värdcellen genom endocytos 5. Denna metod är lämplig för både liten skala (30 ml) och storskalig (upp till 300 ml) experiment och kan producera höga nivåer av renade proteinkomplex. Det är särskilt användbart för att studera proteiner som kräver komplexa fällbara maskiner, co-faktorer eller specifika posttranslationella modifieringar som inte kan utföras av bakterier, jäst och insektsceller.
I detta protokoll presenterar vi uttrycket och reningen av de tre-proteinet central byggnadsställning från Sin3A transkription repression komplex. Denna består av HistonDeacetylase 1 (HDAC1), Suppressor av Defekt Tysta 3 (SDS3) och Switch oberoende 3 (Sin3A). Det renade komplexet används för hög genomströmning kristallisering prövningar.
Vi har utvecklat en enkel och kostnadseffektiv metod (PEI kostar mycket mindre än kommersiellt tillgängliga lipofila transfektionsreagens) för att uttrycka och rena stora mängder av rekombinanta proteiner och fler subenhet komplex från däggdjursceller. Optimal transfektion och uttryck effektivitet kan uppnås om mycket rent plasmid-DNA (260/280 mellan 1,8 och 2,0) används i kombination med PEI som beskrivs i protokollet avsnittet. Celler bör odlas i serum-och antibiotikafritt medium därför steril teknik är absolut nödvändigt för passaging och transfektion av celler i syfte att undvika kostsamma och tidskrävande infektioner. Cellviabilitet bör vara 90% eller högre och kulturer inte får odlas till densiteter större än 2,5 x 10 6 celler / ml omedelbart före en transfektion, eftersom detta kommer att minska proteinavkastning. För en lyckad transfektion bör kulturer bara innehålla enkla eller delande celler. Kluster kan brytas upp av kraftligt virvling 20-30 sek (Figur 5). Förhållandet av varje plasmid som används i sam-transfektion kan varieras av användaren i enlighet med stökiometrin för komplexet som studeras. Expression effektivitet kan optimeras för proteinet av intresse, så att man kan fastställa en lämplig expressionstiden. Rening ska utföras hålla proteinprovet kallt hela tiden för att minska risken för oönskad proteolytisk nedbrytning. Valet av taggar och reningsbuffertar är kritisk, eftersom de kan störa konstruktionselement eller aktiva områden av vissa proteiner, ofta resulterar i minskad löslighet och / eller förlust av enzymatisk aktivitet. Småskaliga transfektioner är särskilt användbara för att testa olika konstruktioner för rening av stora proteinkomplex.
Idag, en stor variation av alternativa metoder är tillgängliga för uttryck av rekombinanta eukaryota proteiner (Tabell 2). Exempelvis Baculovirus uttryck i insektsceller används ofta på grund av dess höga transduktion effektivitet och dess brist på cytotoxicitet i jämförelse med andra virusarter 6. Dock är processen att göra viruset tidskrävande och dess instabilitet tillåter inte det virus som skall lagras under långa perioder. Å andra sidan, jästexpressionssystem erbjuder möjligheten att odla celler till mycket höga densiteter i jästanken kulturer, vilket resulterar i höga proteinutbyten 7. Men de fortfarande saknade fullständig mängd posttranslationella modifieringar som erfordras för eukaryota proteiner att vikas korrekt och interagera med sina proteinpartner. HDAC3 exempelvis uttrycks men inte vika i E. coli. Emellertid när den uttrycks i 293F-celler, kunde vi för att rena ett aktivt enzym i komplex med dess sam-repressor (SMRT) och en molekyl av inositoltetrafosfat (IP4) 8, som inte påträffas i prokaryota celler. Metoden har också gett oss möjlighet att rena och lösa kristallen structure av HDAC1 interagera med MTA1 i NuRD komplexet, som på liknande sätt aktiveras av IP4 9. Helst skulle vi alltid vilja uttrycka eukaryota proteiner i sin naturliga, fysiologiska miljön. Däggdjursexpressionssystem som använder HEK 293-EBNA1 celler i bioreaktorer 10-12 har beskrivits och ger mycket höga nivåer av protein, men dessa kan vara komplicerat att använda.
Vår metod är ett enkelt och lättillgängligt alternativ till uttryck i bakterier, jäst och bioreaktorsystem. Uttrycket Metoden är snabb och kräver inte användning av dyr utrustning, i synnerhet om rullflaska eller-kolv atmosfär ersätts med 5% CO2 och standard skakande inkubatorer används. Vi har använt dessa protokoll till co-transfektera flera plasmider och rena komplex med upp till fem proteiner med utbyten av> 1 mg / L av kultur. Intressant, hjälper systemet att identifiera stabila väluppfostrade komplex. Exempelvis expression av det binära komplexet av HDAC1 och Sin3A gav begränsade utbyten av protein, men tillägg av SDS3 resulterade i 5-faldigt högre belopp och därmed styr den strukturella biologen i valet av lämpliga konstruktioner och stabila komplex för kristallisering.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Dr Xiaowen Yang (PROTEX kloning tjänst) för framställning av expressionskonstruktioner som används för detta arbete och universitetet i Leicester Kärn Bioteknik Services. Detta arbete stöddes av ett BBSRC anställning, Wellcome Trust-programmet och Senior Investigator bidrag WT085408 & WT100237 och BBSRC bevilja RM31G0224.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
FreeStyle HEK 293F cells | LifeTechnologies | R790-07 | |
FreeStyle 293 Expression Medium | LifeTechnologies | 12338-018 | |
Anti-FLAG M2 Affinity Gel | SIGMA | A220 | |
250 ml Erlenmeyer Flask with Vented Cap | Corning | 431144 | |
Roller bottles with vented caps | Corning | 01836-02 | |
Polyethylinamine, 25 kDa, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | Make 0.5 mg/ml stocks in H2O, adjust pH to 7.0 with dilute HCl and store at -20 – 4ºC |
Mammalian expression vector | – | – | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
0.22 µm Centrifugal Filter Units | Amicon | UFC30GV00 | |
15 ml Ultra centrifugal filters (10 kDa cut-off) | Amicon | UFC901008 | |
Superdex 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17-5175-01 |