The expression of recombinant proteins by mammalian systems is becoming an attractive method for producing protein complexes for structural biology. Here we present a simple yet highly efficient expression system using suspension grown mammalian cells to purify protein complexes for structural studies.
The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two decades, prokaryotic expression systems such as E. coli have dominated the scientific literature over costly and less efficient eukaryotic cell lines. Despite the clear advantage in terms of yields and costs of expressing recombinant proteins in bacteria, the absence of specific co-factors, chaperones and post-translational modifications may cause loss of function, mis-folding and can disrupt protein-protein interactions of certain eukaryotic multi-subunit complexes, surface receptors and secreted proteins. The use of mammalian cell expression systems can address these drawbacks since they provide a eukaryotic expression environment. However, low protein yields and high costs of such methods have until recently limited their use for structural biology. Here we describe a simple and accessible method for expressing and purifying milligram quantities of protein by performing transient transfections of suspension grown HEK (Human Embryonic Kidney) 293F cells.
Moleküler hücre biyolojisi hızlı ilerleme ve tıp geliştirilmiş ilaçların sürekli bir ihtiyaç yapısal biyologlar giderek daha karmaşık protein yapılarının bakmak için bir ihtiyaç yarattı. Bu genellikle karmaşık bir katlama ve enzimatik aktivitesini desteklemek için özel bir post-translasyonel modifikasyonlar, moleküler şaperonlar ve ko-faktörlerini de gerektirebilir. Bakteriyel ekspresyon sistemleri kullanılarak elde edilmiştir Protein Data Bank mevcut yapıların büyük çoğunluğu iken, prokaryotes bu değişiklikler çok sayıda yapamazsanız ve birçok temel ökaryot ko-faktörler yoksundur. Bu küçük sinyal molekülleri tarafından yanı sıra nükleer, hücre yüzeyinde ve ayrıntılı katlama makineleri gerektiren salgılanan proteinler aktive edilmiş büyük çok-alt birim komplekslerinin çalışma için bir sorun olabilir. E. bir dizi coli suşları bu sınırlamaların 1 bazılarının üstesinden gelmek için tasarlanmış edilmiştir. M Son yıllarda, ancak, kullanımonlar güvenilir diğer sistemlerde 2 ifade aksi takdirde sorunlu ökaryotik proteinler üretmek çünkü ammalian ifade sistemleri artmaktadır. Bugün kimyasal aracılığında transfeksiyon, viral transdüksiyon arasında değişen çeşitli teknikler vasıtasıyla kararlı ve geçici memeli ifadesi hücre çizgileri elde etmek mümkündür, örneğin elektroporasyon, doğrudan enjeksiyon 3 fiziksel gen transferi. Bu yöntemlerin hepsi avantaj ve dezavantajları kendi seti var ise, bunlardan sadece birkaç ya da çok pahalı ve / veya zaman alıcı olmak yapısal çalışmalar için uygundur.
Burada askı büyümüş memeli hücrelerinde yapısal biyoloji, protein kompleksleri ifade etmek için, çok basit, hızlı, ucuz ama son derece etkili bir yöntem açıklanmaktadır. Yaklaşım (örneğin, 293F Serbest HEK hücreleri) bir insan embriyonik böbrek (HEK) hücre hattının geçici ko-transfeksiyon kullanır. Bu hücreler, HEK 293 mesaf elde edilmiştirII hattı, serumsuz ortam kullanılarak yüksek yoğunluğa (örneğin 293 Antarctica sentezlenmesi ortamı) ulaşan, süspansiyon kültürleri içinde büyümeye adapte edilir. Hücreler, bundan sonra, geçici polietilenimin dallı bir versiyonu (PEI), endositoz 5 konak hücre içine girer, DNA / PEI kompleksleri oluşturarak memeli hücrelerinin 4 arasında geniş bir aralıkta çalışması için rapor edilmiş bir ucuz polimerik bir reaktif kullanılarak transfekte edilir. Bu yöntem büyük ölçekte (30 mi) ve (300 ml kadar) büyük ölçekli deneyler için uygundur ve saflaştırılmıştır protein komplekslerinin yüksek seviyelerde üretebilir. Bu kompleks bir katlama makineleri, ko-faktörler ya da bakteri, maya ve böcek hücreleri tarafından yapılamaz, özellikle post-translasyonel modifikasyonlar gerektiren protein çalışmaları için yararlıdır.
Bu protokolde Sin3A transkripsiyonel represyon kompleksinden üç proteinin merkezi skafoldun ifadesi ve saflaştırılması sunuyoruz. Bu histon oluşmaktadırDeacetylase 1 (HDAC1), Arızalı suskunluğu 3 (SDS3) arasında Supresor ve Switch-bağımsız 3 (Sin3A). Arıtılmış karmaşık ve yüksek verimlilik kristallendirme çalışmalarında kullanılmaktadır.
Bu ifade ile, rekombinant proteinleri ve memeli hücrelerinden çoklu bir alt birim kompleksinin saflaştırılması için büyük miktarda (PEI'ler ticari olarak temin edilebilen lipofilik transfeksiyon reaktifleri daha az maliyeti), bir basit ve uygun maliyetli bir yöntem geliştirdik. Protokol bölümünde tarif edildiği gibi, son derece saf DNA (260/280 1.8 ila 2.0) PEI ile bir arada kullanıldığında, optimum transfeksiyon ve ekspresyon etkinliği ulaşılabilir. Hücreler serum- ve antibiyotik içermeyen ortam içinde kültür olmalıdır, bu nedenle sıkı bir şekilde steril teknik pahalı ve zaman alıcı enfeksiyonları önlemek için pasaj ve transfekte hücreler için gereklidir. Hücre canlılığı,% 90 ya da daha yüksek olmalıdır ve kültürler 2.5 x 10 6 hücre daha yüksek yoğunlukları ile olmamalıdır / hemen transfeksiyondan önce, bu sayede protein verimini düşürür ml. Başarılı transfeksiyon için, kültürler, sadece tek ya da bölünen hücreleri içermelidir. Kümeler gayretle tarafından kırılmış olabilir30 sn (Şekil 5) için lı vorteksleme 20. Ko-transfeksiyon kullanılan her plazmid oranı incelenmiştir olan kompleks bir karma bilgisine göre kullanıcı tarafından değiştirilebilir. Bir kez uygun bir ekspresyon kurulabilir, böylece sentezlenmesi verimliliği, ilgilenilen protein için optimize edilebilir. Arıtma istenmeyen proteolitik bozulması riskini azaltmak için her zaman, protein numune soğuk tutmak yapılmalıdır. Genellikle daha düşük çözünürlük ve / veya enzimatik aktivite kaybı ile sonuçlanan, yapısal elemanlar veya belli proteinlerin aktif alanlarının müdahale edebilir yana etiketler ve saflaştırma tamponların seçimi kritiktir. Küçük ölçekli transfeksiyon, büyük protein komplekslerinin saflaştırılması için çeşitli konstruktlarının test edilmesi için özellikle yararlıdır.
Bugün, farklı yöntem büyük bir çeşitlilik rekombinant proteinlerin ökariyotik (Tablo 2) ekspresyonu için kullanılabilir. Örneğin, Baculoviböcek hücrelerinde sentezleme rus yaygın olarak yüksek transdüksiyon verimliliği ve diğer viral türler 6 ile karşılaştırıldığında sitotoksisite eksikliğine bağlı olarak kullanılır. Bununla birlikte, virüs verme süreci, zaman alıcıdır ve istikrarsızlık virüs uzun süre saklanmasına izin vermez. Öte yandan, maya ekspresyon sistemleri, yüksek protein verimi 7 sonuçlanan fermentasyon kültürlerde hücre çok yüksek yoğunluklar büyüme ihtimalini sunmaktadır. Ama yine de doğru katlanmayacak ve protein partnerleri ile etkileşim için gereken ökariyotik proteinlerin post-translasyonel modifikasyonlar tam çeşitli yoksundur. HDAC3, örneğin, eksprese edilir, fakat E'de bükülmemesini coli. 293F hücrelerinde ifade Ancak, onun ortak bastıncısı (SMRT) ve prokaryotik hücrelerde bulunmayan inositol tetrafosfat (IP4) 8, bir molekül ile kompleks aktif enzimin saflaştırılması mümkün. Bu yöntem ayrıca st arındırmak ve kristal çözmek için bize izin verdiHDAC1 üzerindeki etkisi benzer şekilde 9 IP4 aktive edilir nurd kompleksinde mta1 etkileşim kezlerinin. İdeal olarak, biz her zaman onların doğal, fizyolojik bir ortamda ökaryotik proteinleri ifade etmek istiyorum. Biyoreaktörler 10-12, HEK 293, EBNA1-hücreleri kullanan memeli ekspresyon sistemleri de tarif edilen ve proteininin çok yüksek seviyelerini elde edilmiştir, fakat bu kullanımı da karmaşıktır olabilir edilmiştir.
Önerilen yöntem, bakteri, maya ve biyoreaktör sistemlerinde tanımlanması için basit ve erişilebilir bir alternatiftir. Ekspresyon yöntem hızlıdır ve silindir şişe, kavanoz bir atmosfer,% 5 CO2 ve standart çalkalanarak kuluçka kullanılan ile değiştirilir, özellikle pahalı ekipman kullanımını gerektirmez. Birden fazla plazmidler ortak transfeksiyonu ve kültürü içinde> 1 mg / L'lik bir verimle en fazla beş proteinlerle de kompleksler saflaştırmak için aşağıdaki protokol kullanılmıştır. İlginç bir şekilde, sistem kararlı uslu komplekslerinin tanımlanmasını sağlar. Örneğin, exHDAC1 ve Sin3A ikili kompleksinin sıkıştırma protein sınırlı verimlerini verdi, ancak SDS3 ilavesi daha yüksek miktarlarda 5-kat ve bu nedenle uygun yapılar ve kristalize edilmesine yönelik olarak kararlı kompleksler seçimi yapısal biyologdan kılavuzları ile sonuçlanmıştır.
The authors have nothing to disclose.
Biz bu iş ve Leicester Çekirdek Biyoteknoloji Hizmetleri Üniversitesi için kullanılan ifade yapıları hazırlamak için Dr Xiaowen Yang (PROTEX klonlama servisi) teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma BBSRC öğrencilikle tarafından desteklenen, Wellcome Trust Programı ve Kıdemli Araştırmacı hibe WT085408 & WT100237 ve BBSRC RM31G0224 hibe.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
FreeStyle HEK 293F cells | LifeTechnologies | R790-07 | |
FreeStyle 293 Expression Medium | LifeTechnologies | 12338-018 | |
Anti-FLAG M2 Affinity Gel | SIGMA | A220 | |
250 ml Erlenmeyer Flask with Vented Cap | Corning | 431144 | |
Roller bottles with vented caps | Corning | 01836-02 | |
Polyethylinamine, 25 kDa, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | Make 0.5 mg/ml stocks in H2O, adjust pH to 7.0 with dilute HCl and store at -20 – 4ºC |
Mammalian expression vector | – | – | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
0.22 µm Centrifugal Filter Units | Amicon | UFC30GV00 | |
15 ml Ultra centrifugal filters (10 kDa cut-off) | Amicon | UFC901008 | |
Superdex 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17-5175-01 |