Realtid avbildning av axonal transport av Quantum Dot-märkta BDNF i primära neuroner
Summary
Axonal transport av BDNF, en neurotrofisk faktor, är avgörande för överlevnaden och funktionen av flera neuronala populationer. Vissa degenerativa sjukdomar kännetecknas av avbrott i axonal struktur och funktion. Vi demonstrerade de tekniker som används för att undersöka levande handel med QD-BDNF i mikroflödeskammare som använder primära neuroner.
Abstract
BDNF spelar en viktig roll i flera aspekter av neuronal överlevnad, differentiering och funktion. Strukturella och funktionella brister i axoner alltmer ses som en tidig funktion av neurodegenerativa sjukdomar, däribland Alzheimers sjukdom (AD) och Huntingtons sjukdom (HD). Ännu oklart är mekanismen (er) genom vilka axonal skada induceras. Vi rapporterade att utveckla en ny teknik för att producera biologiskt aktiv, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) som kan användas för att spåra axonal transport av BDNF. Quantum dot-märkta BDNF (QD-BDNF) producerades genom konjugering quantum dot 655 till mBtBDNF. En mikrofluidikanordning användes för att isolera axoner från neuron cell organ. Tillsats av QD-BDNF till axonal utrymmet tillät levande avbildning av BDNF transporter i axoner. Vi visade att QD-BDNF flyttade huvudsak uteslutande retrograd, med mycket få pauser, vid en rörelsehastighet på cirka 1,06 um / sek. Detta system kan användas för att undersöka migchanisms av störd axonal funktion i AD eller HD, liksom andra degenerativa sjukdomar.
Introduction
Nervceller är starkt polariserade celler vars långa och ofta mycket utarbetade processer är grundläggande för att etablera och upprätthålla struktur och funktion av neurala kretsar. Axonet spelar en viktig roll i genomförandet laster till och från synapser. Proteiner och organeller syntetiserade i cellen soma behöva transporteras genom axoner att nå den presynaptiska terminalen att stödja neuronal funktion. På motsvarande mottagna signaler vid distala axoner måste transducerad och förmedlas till soma. Dessa processer är avgörande för neuronal överlevnad, differentiering och underhåll. I det axonal transport i vissa nervceller ska ske genom sträckor mer än 1000 gånger diametern på cellkroppen, är möjligheten lätt föreställa sig att även små underskotten markant kan påverka neuronala och kretsfunktion.
Brain-derived neurotrophic factor (BDNF), en medlem av neurotrofin familjen av tillväxtfaktorer, finns i maNY hjärnan, bland annat hippocampus, hjärnbarken och basala framhjärnan. BDNF spelar en avgörande roll i kognition och minnesbildning genom att stödja överlevnad, differentiering och funktion av nervceller som deltar i kognitiva kretsar. BDNF binder till sin receptor, tyrosinkinaset TrkB, vid axonet terminalen där den aktiverar trkB-förmedlad signalvägar inklusive mitogen aktiverat proteinkinas / extracellulära signalreglerade proteinkinas (MAPK / ERK), fosfatidylinositol-3-kinas (PI3K) och fosfolipas C-gamma (PLCγ). De proteiner som deltar i dessa signalvägar är förpackade på endocytiska vesikulära strukturer för att bilda BDNF / TrkB signal endosom 1-6 som sedan retrograd transporteras till neuronala soma.
Den mikroflödes kulturen Kammaren är en mycket användbar plattform för att studera axonal biologi under normala förhållanden och i fastställandet av skada och sjukdom 7,8. Genom att isolera axonernafrån cellkroppar, har enheten får en att studera transport specifikt i axoner 8-10. PDMS baserade mikroflödes plattformar med 450 | im mikrospår barriärer användes i denna studie var kommersiellt köpt (se Material tabell). För att undersöka BDNF transporter har vi utvecklat en ny teknik för att producera monobiotinylated BDNF (mBtBDNF). Vi drog fördel av biotin accept peptiden, AP (även känd som AviTag). Det är en 15 aminosyrasekvens som innehåller en lysinrest som specifikt kan ligeras till en biotin från Escherichia coli enzym biotin-ligas, BirA. Vi fuserade den AviTag till C-terminalen av mus-pre-proBDNF cDNA genom PCR (Figur 1A). Konstruktionen klonades in i däggdjursexpressionsvektor, pcDNA3.1 myc-sin vektor. Vi klonade också den bakteriella BirA DNA i pcDNA3.1 myc-hans vektor. De två plasmiderna transient samtransfekteras in HEK293FT celler att uttrycka båda proteinerna. BirA katalyseras ligering av bioti specifikt till lysin uppehålla sig inom AviTag vid C-terminalen av BDNF vid en 1: 1-förhållande för att producera monobiotinylated BDNF-monomeren. Biotinylated, mogen BDNF med en molekylmassa på ~ 18 kDa utvinns och renas från media med Ni-harts (Figur 1C). Den biotinylering av BDNF var fullständig, att döma av oförmågan att upptäcka omodifierad BDNF genom immun (Figur 1D). Streptavidin konjugerade kvantprickar, QD 655, användes för att märka mBtBDNF att QD-BDNF. Närvaron av AviTag inte störa aktiviteten av BDNF som mBtBDNF kunde aktivera fosforyleras TrkB (Figur 1E) och stimulera neuritutväxt (Figur 1F) i den omfattning av rekombinant humant BDNF (rhBDNF). Immunfärgning visat att QD-BDNF colocalized med TrkB i hippocampus axoner, vilket indikerar att QD-BDNF är bioaktiva (figur 1G). För att studera BDNF transport, var QD-BDNF läggs till distal axon fackmikroflödes kulturer innehållande råtta E18 hippocampus nervceller (Figur 2A). QD-BDNF retrograd transport inom axoner fångades av realtids levande avbildning av den röda fluorescerande tagg (Supporting videos S1, S2). Genom att analysera kymograph genereras, var QD-BDNF observerade transporteras retrograd vid en rörelsehastighet på cirka 1,06 um / s (Figur 3A). GFP eller mCherry-märkt BDNF har använts för att spåra axonal rörelse av BDNF. De största nackdelarna är att de inte är tillräckligt ljust för enstaka molekyl studier. Även förekomsten av både antero och bakåtsträvande BDNF rörelser gör det svårt att bedöma om den retrograd transporteras BDNF var i en neurotrofin / receptorkomplexet.
I den här videon visar vi de tekniker som används för att undersöka levande handel med QD-BDNF i mikroflödeskammare med hjälp av primära neuroner. Den ultrabrightness och utmärkt fotostabilitet av kvantprickar makes det möjligt att utföra långsiktiga spårning av BDNF transport. Dessa tekniker kan utnyttjas för att öka studier av axonal funktion i AD, HD och andra neurodegenerativa sjukdomar.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna studie rapporterar vi utvecklingen av en ny teknik för att producera biologiskt aktiv, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) som kan användas för att spåra axonal transport av BDNF. Genom att konjugera proteinet till quantum dot streptavidin, och med användning av en mikroflödeskammare, tillåter metoden ett att detektera axonal transport av BDNF i primära nervceller med enda molekyl känslighet, i realtid och med rumslig och temporal upplösning. De verktyg som används här ger ett medel för att studera de m…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Yue (Pauline) Hu, Rachel Sinit för deras tekniska stöd. Studien stöds av NIH bidrag (PN2 EY016525) och genom finansiering från Down Syndrome Research and Treatment Foundation och Larry L. Hillblom Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number |
| Platinum pfx DNA polymerase | Invitrogen | 11708021 |
| EcoRI | Fermentas | FD0274 |
| BamHI | Fermentas | FD0054 |
| HEK293FT cells | Invitrogen | R70007 |
| DMEM-high glucose media | Mediatech | 10-013-CV |
| d-biotin | Sigma | B4639 |
| TurboFect | Fermentas | R0531 |
| PMSF | Sigma | P7626 |
| aprotinin | Sigma | A6279 |
| Ni-NTA resins | Qiagen | 30250 |
| protease inhibitors cocktail | Sigma | S8820 |
| silver staining kit | G-Biosciences | 786-30 |
| human recombinant BDNF | Genentech | |
| Microfluidic chambers | Xona | SND450 |
| 24×40 mm No. 1 glass coverslips | VWR | 48393-060 |
| poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 |
| HBSS | Gibco | 14185-052 |
| DNase I | Roche | 10104159001 |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 |
| GlutaMax | Invitrogen | 35050-061 |
| B27 | Gibco | 17504-044 |
| QD655-streptavidin conjugates | Invitrogen | Q10121MP |
| anti-Avi tag antibody | GenScript | A00674 |
| streptavidin-agarose beads | Life Technology | SA100-04 |
| trichloroacetic acid | Sigma | T6399 |
| HRP-streptavidin | Thermo Scientific | N100 |
| anti-pTrkB antibody | a generous gift from Dr M. Chao of NYU | |
| anti-TrkB antibody | BD Science | 610101 |
Riferimenti
- Wu, C., et al. A functional dynein-microtubule network is required for NGF signaling through the Rap1/MAPK pathway. Traffic. 8, 1503-1520 (2007).
- Wortzel, I., Seger, R. The ERK Cascade: Distinct Functions within Various Subcellular Organelles. Genes & cancer. 2, 195-209 (2011).
- Huang, E. J., Reichardt, L. F. Trk receptors: roles in neuronal signal transduction. Annual review of biochemistry. 72, 609-642 (2003).
- Nonomura, T., et al. Signaling pathways and survival effects of BDNF and NT-3 on cultured cerebellar granule cells. Brain research. Developmental brain research. 97, 42-50 (1996).
- Weissmiller, A. M., Wu, C. Current advances in using neurotrophic factors to treat neurodegenerative disorders. Translational neurodegeneration. 1, 14 (2012).
- Zhang, K., et al. Defective axonal transport of Rab7 GTPase results in dysregulated trophic signaling. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 7451-7462 (2013).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature methods. 2, 599-605 (2005).
- Cui, B., et al. One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).
- Xie, W., Zhang, K., Cui, B. Functional characterization and axonal transport of quantum dot labeled BDNF. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4, 953-960 (2012).
- Sung, K., Maloney, M. T., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of neuroscience methods. 200, 121-128 (2011).
- Tani, T., et al. Trafficking of a ligand-receptor complex on the growth cones as an essential step for the uptake of nerve growth factor at the distal end of the axon: a single-molecule analysis. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2181-2191 (2005).
- Bronfman, F. C., Tcherpakov, M., Jovin, T. M., Fainzilber, M. Ligand-induced internalization of the p75 neurotrophin receptor: a slow route to the signaling endosome. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 3209-3220 (2003).
- Kruttgen, A., Heymach, J. V., Kahle, P. J., Shooter, E. M. The role of the nerve growth factor carboxyl terminus in receptor binding and conformational stability. The Journal of biological chemistry. 272, 29222-29228 (1997).
- Zuccato, C., Cattaneo, E. Brain-derived neurotrophic factor in neurodegenerative diseases. Nature reviews. Neurology. 5, 311-322 (2009).
- Gharami, K., Xie, Y., An, J. J., Tonegawa, S., Xu, B. Brain-derived neurotrophic factor over-expression in the forebrain ameliorates Huntington’s disease phenotypes in mice. Journal of neurochemistry. 105, 369-379 (2008).
- Gauthier, L. R., et al. Huntingtin controls neurotrophic support and survival of neurons by enhancing BDNF vesicular transport along microtubules. Cell. 118, 127-138 (2004).
- Her, L. S., Goldstein, L. S. Enhanced sensitivity of striatal neurons to axonal transport defects induced by mutant huntingtin. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 13662-13672 (2008).
- Rong, J., et al. Regulation of intracellular trafficking of huntingtin-associated protein-1 is critical for TrkA protein levels and neurite outgrowth. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 6019-6030 (2006).
