اللسان الإلكترونية توليد أنماط الاعتراف المستمر لتحليل البروتين
Summary
A novel approach is described for construction of electronic tongue (eT), which greatly simplifies the design and production of sensing materials, and allows the eT to generate continuous evolution profiles and landscapes for samples in liquid. The obtained eT is efficient for common protein analysis such as discrimination.
Abstract
In current protocol, a combinatorial approach has been developed to simplify the design and production of sensing materials for the construction of electronic tongues (eT) for protein analysis. By mixing a small number of simple and easily accessible molecules with different physicochemical properties, used as building blocks (BBs), in varying and controlled proportions and allowing the mixtures to self-assemble on the gold surface of a prism, an array of combinatorial surfaces featuring appropriate properties for protein sensing was created. In this way, a great number of cross-reactive receptors can be rapidly and efficiently obtained. By combining such an array of combinatorial cross-reactive receptors (CoCRRs) with an optical detection system such as surface plasmon resonance imaging (SPRi), the obtained eT can monitor the binding events in real-time and generate continuous recognition patterns including 2D continuous evolution profile (CEP) and 3D continuous evolution landscape (CEL) for samples in liquid. Such an eT system is efficient for discrimination of common purified proteins.
Introduction
أساليب البروتين الاستشعار الدقيقة والسريعة مهمة جدا في التشخيص الطبي والبروتينات. وتستند المصفوفات للكشف عن البروتين الكلاسيكية، مثل biochips، على "قفل ومفتاح" مبدأ الاعتراف وتتطلب مستقبلات محددة مثل الأبتامرات، والأجسام المضادة، أو علم المحاكاة الحيوية.
في السنوات الأخيرة، والاستشعار التفاضلية مستوحاة من الشم والذوق البشري برزت كبديل 1. هذا الأنف الالكتروني / اللسان ويستند (EN / ET) على نهج التفاضلية ملزمة من التحاليل لمجموعة من مستقبلات عبر رد الفعل (CRRs)، التي لا تحتاج إلى أن تكون محددة للغاية أو انتقائية لالجزيئات المستهدفة وبالتالي تسمح للتغلب على شاقة عملية تطوير مستقبلات انتقائية للغاية. هو استجابة مشتركة من جميع المستقبلات التي تخلق نمطا واضحا لكل عينة، مثل بصمات الأصابع، مما يسمح لها هوية.
التحديات الرئيسية لتطوير اثنين من الكابلات الكهربائية المصريةترونيك الأنف / اللسان للاستشعار عن بروتين فعال هي إنتاج عناصر الاستشعار التي لديها القدرة على التمييز بين التحاليل مماثلة هيكليا ونظام التنبيغ الملائم للحدث ملزم. حتى الآن، وقد أفادت دراسات الطرق المختلفة لتطوير مجموعة 2. على سبيل المثال في دراسة واحدة تم وضع تحديد القائم على مجموعة من البروتينات باستخدام CRRs المحضرة من مشتقات رباعي carboxyphenylporphyrin بواسطة اقتران مجموعات الكربوكسيل لمختلف الأحماض الأمينية أو dipeptides لتوفير مستقبلات الفارق حيازة مسعور الأساسية للتقارب للبروتينات والأطراف اتهم متميزة ل إضفاء التفاضلية ملزمة. باستخدام هذا النظام، تم تحديد البروتينات المختلفة، وخليط من البروتين عن طريق قياس التبريد مضان من المستقبلات على التفاعل مع التحاليل 3،4. في دراسة أخرى، ومكتبة من 29 CRRs تحتوي على حمض ثلاثي الببتيد والأنصاف boronic توليفها بطريقة اندماجي على hexasubstiوقد وضعت tuted سقالة البنزين للاستشعار عن البروتينات مع كشف-مؤشر امتصاص اللونية 5،6. مع مثل هذا التصميم، وأظهر قدرة كل مستقبلات ملزمة التفاضلية مع البروتينات على أساس التباين في أحضان الببتيد، والأحماض boronic ساعدت في التفريق بين البروتينات من بروتينات سكرية. وفي الآونة الأخيرة، تم إنشاء مجموعة تتألف من مختلف الموجبة بين functionalized جزيئات الذهب مترافق مع أنيوني بولي الفلورسنت البوليمر (ف phenyleneethynylene) (PPE) لكشف وتحديد البروتينات 7. ربط تنافسية بين التحاليل البروتين وتطفئ PPE / الذهب المجمعات جسيمات متناهية الصغر مجدد مضان، وإنتاج أنماط الاعتراف متميزة للبروتينات. في هذه الدراسة تم ضبطها بين functionalized التفاعلات جسيمات متناهية الصغر من البروتين من خلال تغيير الخصائص الفيزيائية للجماعات نهاية جسيمات متناهية الصغر. وعلاوة على ذلك، فقد تبين أن هذا النهج هو فعال لتحليل البروتين في مجمع المتوسطة والغنية بالبروتين مثلكما المصل البشري في تركيزات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية، مما يدل على إمكانات وآخرون في التنميط عينات حقيقية لتشخيص الحالات المرضية 8.
على الرغم من واعدة جدا، وهذه النظم لديها بعض القيود المتأصلة. أنها تتطلب تصميم وتجميع 5-29 CRRs مع هياكل معقدة للغاية. وبالإضافة إلى ذلك، على عكس نظام حاسة الشم التي تتم إعادة تعيين بعد كل قياس، يتطلب البروتين الاستشعار عن إعداد مجموعة لكل عينة. أخيرا، ورصد في الوقت الحقيقي الأحداث ملزمة صعبة للغاية.
في هذا السياق، اقترح نهج اندماجي باستخدام عدد قليل من جزيئات بسيطة ويمكن الوصول إليها بسهولة مع الخصائص الفيزيائية المختلفة (ماء، مسعور، موجبة، سالبة الشحنة، محايد، الخ.) لبنات البناء (BBS) 9. عن طريق خلط بب في نسب متفاوتة ورقابة والسماح للخليط في تقرير المصير، التجمع على سطح الذهب لالمنشور، تم إنشاء مجموعة من الأسطح اندماجي يضم الخصائص الملائمة للبروتين ملزمة. تجدر الإشارة إلى أن الطبقات الوحيدة الذاتي تجميعها على هذا النظام تسمح السهل ضبط مجموعة من خصائص سطح بطريقة متباينة للغاية، مما المتنوعة اندماجي مستقبلات عبر رد الفعل (CoCRRs) إلى أن يتم إنتاجها بسرعة وكفاءة. تم تنفيذ الاستشعار البروتين باستخدام نظام كشف بصري، سطح مأكل التصوير بالرنين (سبري). لفترة وجيزة، وهو واسع شعاع الضوء المستقطب أحادية اللون من LED تضيء كامل منطقة مجموعة CoCRR على سطح المنشور. توفر كاميرا الفيديو عالية الدقة CCD الصور الفرق في الوقت الحقيقي عبر جميع البقع من مجموعة CoCRR. فإنه يلتقط كافة التغييرات المحلية على السطح من مجموعة CoCRR توفير معلومات مفصلة عن ملزم الأحداث والعمليات الحركية 10. وفي الوقت نفسه، مع مساعدة من برامج التصوير، يتم تحويل الصور SPR الموافق البقع تلقائيا إلى الاختلافات انعكاسية VERSUحان الوقت، وتوليد سلسلة من المنحنيات الحركية ملزمة دعا sensorgrams. وبالتالي، سبري يسمح الملاحظة، متزامن، موازية، خالية من التسمية والوقت الحقيقي من الأحداث ملزمة. بالإضافة إلى ذلك، مجموعة CoCRR عليها regenerable ويمكن إعادة استخدامها لتحليل البروتين.
يصف هذا البروتوكول بناء اللسان الإلكترونية باستخدام اثنين فقط من الجزيئات الصغيرة لبنات البناء ويوضح تطبيقها لتحليل البروتينات المشتركة استنادا إلى أنماط الاعتراف مستمرة تم الحصول عليها مع سبري.
Protocol
Representative Results
Discussion
ملتزمون الخطوات الأكثر أهمية لبناء هذا ET لضمان استنساخ جيد للنظام. على سبيل المثال، وتنظيف سطح الذهب من منظور مع إجراءات موحدة قبل الاستخدام، واضاف ان 10٪ من الجلسرين في أحد عشر حلول النقية والمختلطة وBB1 BB2 للقضاء على تبخر المذيبات خلال بب تجميع الذاتي على سطح الذه?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Ph.D. grant of LANEF in Grenoble for support of Laurie-Amandine Garçon. This work was financially supported by the French National Research Agency (ANR-grant 06-NANO-045).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| SPRi apparatus | Horiba Scientific-GenOptics | SPRi apparatus is placed in a temperature regulated incubator at 25°C. | |
| Incubator | Memmert | ||
| Syringe pump | Cavro scientific instruments | Cavro XLP 6000 | |
| Micro Elite Degasser | Alltech | AT590507 | |
| 6-port medium pressure injection valve | Upchurch Scientific | The volume of injection loop used is 500 µl. | |
| Femto plasma cleaner (version 7) | Diener Electronic | On-line degassing system with 2 channel. | |
| Spotter | Siliflow | It is a non-contact piezoelectric spotter. | |
| SPRi-Biochip | Horiba Scientific-GenOptics | 36000067 | The prism is made of a high refractive index glass prism coated with a thin gold film (45 nm) and specially developed for imaging purposes. |
| erythrina cristagalli lectin | Sigma-Aldrich | L5390 | |
| arachis hypogaea lectin | Sigma-Aldrich | L0881 | |
| myoglobin | Sigma-Aldrich | M1882 | |
| lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| CXCL12α | Provided by Dr. Hugues Lortat-Jacob, for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| CXCL12γ | Provided by Dr. Hugues Lortat-Jacob, for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| lactose | Provided by Prof. David Bonnaffé, for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| sulfated lactose | Provided by Prof. David Bonnaffé, for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| tween 20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 |
Riferimenti
- Margulies, D., Hamilton, A. D. Combinatorial protein recognition as an alternative approach to antibody-mimetics. Current Opinion in Chemical Biology. 14, 705-712 (2010).
- Umali, A. P., Anslyn, E. V. A general approach to differential sensing using synthetic molecular receptors. Current Opinion in Chemical Biology. 14, 685-692 (2010).
- Baldini, L., Wilson, A. J., Hong, J., Hamilton, A. D. Pattern-based detection of different proteins using an array of fluorescent protein surface receptors. J. Am. Chem. Soc. 126, 5656-5657 (2004).
- Zhou, H. C., Baldini, L., Hong, J., Wilson, A. J., Hamilton, A. D. Pattern recognition of proteins based on an array of functionalized porphyrins. J. Am. Chem. Soc. 128, 2421-2425 (2006).
- Wright, A. T., Griffin, M. J., Zhong, Z., McCleskey, S. C., Anslyn, E. V., McDevitt, J. T. Differential receptors create patterns that distinguish various proteins. Angew. Chem. Int. Ed. 44, 6375-6378 (2005).
- Wright, A. T., Anslyn, E. V. Differential receptor arrays and assays for solution-based molecular recognition. Chem. Soc. Rev. 35, 14-28 (2006).
- You, C. C., et al. Detection and identification of proteins using nanoparticle–fluorescent polymer ‘chemical nose’ sensors. Nature Nanotechnology. 2, 318-323 (2007).
- De, M., et al. Sensing of proteins in human serum using conjugates of nanoparticles and green fluorescent protein. Nature Chemistry. 1, 461-465 (2009).
- Hou, Y., et al. Continuous evolution profiles for electronic-tongue-based analysis. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 10394-10398 (2012).
- Campbell, C. T., Kim, G. SPR microscopy and its applications to high-throughput analyses of biomolecular binding events and their kinetics. Biomaterials. 28, 2380-2392 (2007).
- Stranick, S. J., et al. Nanometer-scale phase separation in mixed composition self-assembled monolayers. Nanotechnology. 7, 438-442 (1996).
