Электронный язык Генерация непрерывные узоры признание за анализа белков
Summary
A novel approach is described for construction of electronic tongue (eT), which greatly simplifies the design and production of sensing materials, and allows the eT to generate continuous evolution profiles and landscapes for samples in liquid. The obtained eT is efficient for common protein analysis such as discrimination.
Abstract
In current protocol, a combinatorial approach has been developed to simplify the design and production of sensing materials for the construction of electronic tongues (eT) for protein analysis. By mixing a small number of simple and easily accessible molecules with different physicochemical properties, used as building blocks (BBs), in varying and controlled proportions and allowing the mixtures to self-assemble on the gold surface of a prism, an array of combinatorial surfaces featuring appropriate properties for protein sensing was created. In this way, a great number of cross-reactive receptors can be rapidly and efficiently obtained. By combining such an array of combinatorial cross-reactive receptors (CoCRRs) with an optical detection system such as surface plasmon resonance imaging (SPRi), the obtained eT can monitor the binding events in real-time and generate continuous recognition patterns including 2D continuous evolution profile (CEP) and 3D continuous evolution landscape (CEL) for samples in liquid. Such an eT system is efficient for discrimination of common purified proteins.
Introduction
Точные и быстрые методы белок датчиков очень важно в медицинской диагностике и протеомики. Классические белковые обнаружения массивы, такие как биочипов, основаны на "заблокировать-и-ключа" принципом признания и требуют специфические рецепторы, такие как аптамеров, антитела, или имитаторов.
В последние годы, дифференциал зондирования вдохновлен человеческого обоняния и gustation стала альтернативной 1. Это электронный нос / язык (EN / ET) подход основан на дифференциальных связывания анализируемых на массив перекрестно реагирующих рецепторов (CRRs), которые не должны быть очень специфичными или селективными для молекул-мишеней, таким образом, позволяют преодолеть кропотливая Процесс разработки высокоселективных рецепторы. Это в сочетании ответ всех рецепторов, что создает отдельный шаблон для каждого образца, как отпечатки пальцев, обеспечивающее ее идентификацию.
Два ключевых проблем для развития электоприводтроник нос / язык для эффективного зондирования белка являются производство чувствительных элементов, которые имеют способность различать среди структурно подобных аналитов и соответствующей системы трансдукции для связывания события. До сих пор, исследования показали, различные подходы к развитию массива 2. Например, в одном исследовании на основе массивов идентификация белков была разработана с использованием CRRs, полученных из производных тетра-carboxyphenylporphyrin путем сочетания карбоксильных групп в различных аминокислот или дипептидов, чтобы обеспечить дифференциальные рецепторы, обладающие гидрофобную сердцевину для сродством к белкам и различных заряженных периферии для придания дифференциального связывания. Используя эту систему, различные белки и белковые смеси были определены путем измерения тушение флуоресценции рецепторов при взаимодействии с аналитов 3,4. В другом исследовании, библиотека 29 CRRs содержащих трипептид и остатки борной кислоты синтезируются в комбинаторной пути на hexasubstiщённые бензол эшафот был разработан для измерения белки с индикатором захвата колориметрического обнаружения 5,6. При такой конструкции, каждая из рецепторов показали, дифференциальный связывающую способность с белками на основе различий в пептидных оружия, и борной кислоты при содействии в дифференциации белков из гликопротеинов. Совсем недавно, массив состоит из различных катионных функционализованный наночастиц золота, сопряженных с анионным флуоресцентного полимерной поли (п-phenyleneethynylene) (СИЗ) был создан для обнаружения и идентификации белков 7. Конкурентного связывания между белковыми аналитов и гасят СИЗ / золотые наночастицы комплексов регенерированных флуоресценции, создавая различные узоры распознавания для белков. В этом исследовании, функционализованные наночастицы-белковые взаимодействия были настроены путем изменения физико-химических свойств конечных наночастиц групп. Кроме того, было показано, что такой подход является эффективным для анализа белков в сложной и богатой белком среде, такойкак сыворотке крови человека в физиологически значимых концентрациях, таким образом показывая потенциал ET в профилирования реальные образцы для диагностики болезненных состояний 8.
Хотя очень перспективным, эти системы имеют некоторые ограничения, присущие. Они требуют разработки и синтеза от 5 до 29 CRRs с довольно сложными структурами. Кроме того, в отличие от обонятельной системы, который сбрасывается после каждого измерения, белок, чувствительный требует подготовки массив на выборку. Наконец, мониторинг в реальном времени обязательные мероприятия чрезвычайно трудно.
В этом контексте, комбинаторный подход был предложен с помощью небольшого количества простых и легко доступных молекул с различными физико-химическими свойствами (гидрофильными, гидрофобными, положительно заряженные, отрицательно заряженные, нейтральный и т.д..) В качестве строительных блоков (BBS) 9. Смешивая ББ в различной и контролируемых пропорции и позволяя смесей самостоятельно собираться на золотой поверхностипризма, был создан массив комбинаторных поверхностей с участием соответствующих настроек связывающий белок. Примечательно, что самоорганизующиеся монослои на данной системы позволяют легко настройку диапазона свойств поверхности в сильно расходящихся моды, что позволяет различные комбинаторные кросс-реактивные рецепторы (CoCRRs), чтобы быть быстро и эффективно получать. Белок зондирование проводилось с помощью оптической системы обнаружения, поверхностного плазмонного резонанса (SPRI). Вкратце, широкая балка монохромные поляризованный свет от светодиода освещает всю CoCRR области массива на поверхности призмы. CCD видео камера высокого разрешения в режиме реального времени разница изображения во всех пятен массива CoCRR. Она захватывает все локальные изменения на поверхности массива CoCRR, содержащие подробную информацию о связывающих событий и кинетических процессов 10. Между тем, с помощью ПО для обработки изображений, SPR изображения, соответствующие пятен автоматически преобразуются в вариациях отражения Versuпора, создавая серию кинетических кривых связывания называемых сенсограммы. Таким образом, SPRI позволяет без наклеек, синхронный, параллельно, и в режиме реального времени наблюдать обязательных мероприятий. Кроме того, полученный массив CoCRR является регенерировать и повторно для анализа белков.
Этот протокол описывает конструкцию электронного языка, используя только два небольших молекул в качестве строительных блоков и иллюстрирует его применение для анализа общих белков на основе непрерывных моделей распознавания, полученных с SPRI.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наиболее важные шаги для построения этой ET посвящены обеспечить хорошую воспроизводимость системы. Например, очистка золотую поверхность призмы с стандартизированной процедуры перед использованием, добавляя 10% глицерина в одиннадцати чистых и смешанных растворов ВВ1 и ВВ2, чтобы ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Ph.D. grant of LANEF in Grenoble for support of Laurie-Amandine Garçon. This work was financially supported by the French National Research Agency (ANR-grant 06-NANO-045).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| SPRi apparatus | Horiba Scientific-GenOptics | SPRi apparatus is placed in a temperature regulated incubator at 25°C. | |
| Incubator | Memmert | ||
| Syringe pump | Cavro scientific instruments | Cavro XLP 6000 | |
| Micro Elite Degasser | Alltech | AT590507 | |
| 6-port medium pressure injection valve | Upchurch Scientific | The volume of injection loop used is 500 µl. | |
| Femto plasma cleaner (version 7) | Diener Electronic | On-line degassing system with 2 channel. | |
| Spotter | Siliflow | It is a non-contact piezoelectric spotter. | |
| SPRi-Biochip | Horiba Scientific-GenOptics | 36000067 | The prism is made of a high refractive index glass prism coated with a thin gold film (45 nm) and specially developed for imaging purposes. |
| erythrina cristagalli lectin | Sigma-Aldrich | L5390 | |
| arachis hypogaea lectin | Sigma-Aldrich | L0881 | |
| myoglobin | Sigma-Aldrich | M1882 | |
| lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| CXCL12α | Provided by Dr. Hugues Lortat-Jacob, for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| CXCL12γ | Provided by Dr. Hugues Lortat-Jacob, for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| lactose | Provided by Prof. David Bonnaffé, for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| sulfated lactose | Provided by Prof. David Bonnaffé, for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| tween 20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 |
Riferimenti
- Margulies, D., Hamilton, A. D. Combinatorial protein recognition as an alternative approach to antibody-mimetics. Current Opinion in Chemical Biology. 14, 705-712 (2010).
- Umali, A. P., Anslyn, E. V. A general approach to differential sensing using synthetic molecular receptors. Current Opinion in Chemical Biology. 14, 685-692 (2010).
- Baldini, L., Wilson, A. J., Hong, J., Hamilton, A. D. Pattern-based detection of different proteins using an array of fluorescent protein surface receptors. J. Am. Chem. Soc. 126, 5656-5657 (2004).
- Zhou, H. C., Baldini, L., Hong, J., Wilson, A. J., Hamilton, A. D. Pattern recognition of proteins based on an array of functionalized porphyrins. J. Am. Chem. Soc. 128, 2421-2425 (2006).
- Wright, A. T., Griffin, M. J., Zhong, Z., McCleskey, S. C., Anslyn, E. V., McDevitt, J. T. Differential receptors create patterns that distinguish various proteins. Angew. Chem. Int. Ed. 44, 6375-6378 (2005).
- Wright, A. T., Anslyn, E. V. Differential receptor arrays and assays for solution-based molecular recognition. Chem. Soc. Rev. 35, 14-28 (2006).
- You, C. C., et al. Detection and identification of proteins using nanoparticle–fluorescent polymer ‘chemical nose’ sensors. Nature Nanotechnology. 2, 318-323 (2007).
- De, M., et al. Sensing of proteins in human serum using conjugates of nanoparticles and green fluorescent protein. Nature Chemistry. 1, 461-465 (2009).
- Hou, Y., et al. Continuous evolution profiles for electronic-tongue-based analysis. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 10394-10398 (2012).
- Campbell, C. T., Kim, G. SPR microscopy and its applications to high-throughput analyses of biomolecular binding events and their kinetics. Biomaterials. 28, 2380-2392 (2007).
- Stranick, S. J., et al. Nanometer-scale phase separation in mixed composition self-assembled monolayers. Nanotechnology. 7, 438-442 (1996).
