Introduction
Exakta och snabba proteinanalysmetoder är mycket viktiga i medicinsk diagnostik och proteomik. Klassiska protein upptäcka matriser, såsom biochips, bygger på principen "lock-and-key" erkännande och kräver specifika receptorer såsom aptamers, antikroppar eller mimetics.
Under de senaste åren har differentiell avkänning inspirerad av den mänskliga olfaction och gustation vuxit fram som ett alternativ 1. Denna elektroniska näsan / tungan (sv / eT) strategi bygger på differentiell bindning av analyter till en matris med korsreaktiva receptorer (CRRs), som inte behöver vara mycket specifik eller selektiv för målmolekyler således göra det möjligt att övervinna det mödosamma processen att utveckla selektiva receptorer. Det är den kombinerade svar på alla de receptorer som skapar ett distinkt mönster för varje prov, som ett fingeravtryck, vilket möjliggör dess identifiering.
De två viktigaste utmaningarna för utvecklingen av eltronic näsa / tunga för effektiv protein avkänning är produktionen av sensorelement som har förmågan att skilja mellan strukturellt liknande analyter och lämplig transduktion system för bindande händelsen. Hittills har studier rapporterat olika metoder för array utveckling 2. Till exempel i en studie en array-baserad identifiering av proteiner har utvecklats med CRRs framställda av tetra-carboxyphenylporphyrin derivat genom koppling karboxylgrupperna till olika aminosyror eller dipeptider att ge differential receptorer som har en hydrofob kärna för affinitet för proteiner och olika laddade periferier för förläna differentiell bindning. Med hjälp av detta system har olika proteiner och proteinblandningar identifieras genom att mäta fluorescensdämpning av receptorerna vid interaktion med analyt 3,4. I en annan studie, ett bibliotek med 29 CRRs innehåller tripeptid och borsyra delar syntetiseras i en kombinatorisk väg på en hexasubstitats bensen byggnadsställning utvecklades för att känna av proteiner med en indikator-upptag kolorimetrisk detektion 5,6. Med en sådan konstruktion, varje receptor visade differentialbindningskapacitet med proteiner som bygger på variansen i peptid armar och de boronsyror assisterade i differentiering av proteiner från glykoproteiner. På senare tid har en rad som består av olika katjoniska funktionguldnanopartiklar konjugerade med en anjonisk fluorescerande polymer poly (p-phenyleneethynylene) (PPE) skapats för att upptäcka och identifiera proteiner 7. Konkurrens bindning mellan proteinanalyter och släcktes PPE / guldnanopartiklar komplex regenere fluorescens, som producerar distinkta igenkänningsmönster för proteiner. I denna studie var de funktionaliserade nanopartikel-proteininteraktioner avstämd genom att variera de fysikalisk-kemiska egenskaperna hos nanopartikel ändgrupper. Vidare visade det sig att denna metod är effektiv för proteinanalys i komplex och proteinrikt medium såsomsom humant serum vid fysiologiskt relevanta koncentrationer, vilket visar potentialen i eT profilera verkliga prover för att diagnostisera sjukdomstillstånd 8.
Även mycket lovande, dessa system har vissa inneboende begränsningar. De kräver att designa och syntetisera 5-29 CRRs med ganska komplicerade strukturer. Dessutom, till skillnad från det olfaktoriska systemet som återställs efter varje mätning kräver proteinanalys framställa en array per prov. Slutligen övervakning i realtid bindande händelser är extremt svårt.
I detta sammanhang var ett kombinatoriskt tillvägagångssätt som föreslås genom användning av ett litet antal enkla och lättillgängliga molekyler med olika fysikalisk-kemiska egenskaper (hydrofila, hydrofoba, positivt laddade, negativt laddade, neutrala, osv.) Som byggstenar (BBS) 9. Genom att blanda BBs i varierande och kontrollerade proportioner och låta blandningarna att själv montera på guldytan på enprisma, var en matris av kombinatoriska ytor terar lämpliga egenskaper för bindande protein skapas. Noterbart är de själv monterade monolager på detta system möjliggör enkel inställning av en rad ytegenskaper på ett mycket avvikande sätt, vilket gör att olika kombinatoriska korsreaktiva receptorer (CoCRRs) för att vara snabbt och effektivt producerade. Protein avkänning utfördes med hjälp av ett optiskt detektionssystem, ytplasmonresonans imaging (Spri). Kortfattat, ett bredstråle monochromatic polariserat ljus från en LED tänds hela CoCRR array område på ytan av prismat. En högupplöst CCD-videokamera ger realtid differensbilder över alla fläckar i CoCRR array. Den fångar alla lokala ändringar på ytan av CoCRR array ger detaljerad information om bindande händelser och kinetiska processer 10. Under tiden med hjälp av bildbehandlingsprogram, SPR bilder motsvarande fläckar konverteras automatiskt till variationer av reflektions versus tid, genererar en serie kinetiska bindningskurvor kallas sensorgrammen. Således tillåter Spri en etikett-fri, synkron, parallell, och realtidsobservation av bindningshändelser. Dessutom är den erhållna CoCRR array regenererbar och återanvändas för proteinanalys.
Detta protokoll beskriver konstruktionen av den elektroniska tungan med hjälp av endast två små molekyler som byggstenar och illustrerar dess tillämpning för analys av gemensamma proteiner som bygger på kontinuerliga igenkänningsmönster som erhålls med Spri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Beredning av olika lösningar och Protein Prov
- Bered 100 ml fosfatbuffertlösning (PBS-G), som innehöll 50 mM NaH 2 PO 4, 50 mM NaCl och 10% glycerol vid pH 6,8.
- Bered 250 ml HEPES-buffertlösning innehållande 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,005% Tween 20 vid pH 7,4.
- Bered stamlösning av byggsten 1 (BB1) laktos och byggsten 2 (BB2) sulfat laktos (figur 1) på 0,2 mM i PBS-G.
- Bered 1 ml proteinlösningar i HEPES: En rachis hypogaea lektin (AHL) vid 500 nM, myoglobin vid 1 ^ M, och lysozym vid 500 nM.
- Förbered 20 ml 1% SDS i ultrarent vatten.
2 Beredning av CoCRR Array
- Rengör guldytan prismat 48 timmar före användning med en plasma renare i 3 minuter under dessa förhållanden: 75% syre, 25% argon, 0,6 mbar, effekt 40 W.
- Förbered elva rena och blandade solutions av BB1 och BB2 med [BB1] / ([BB1] + [BB2]) kvoter mellan 0 och 100% i steg om 10% vid en total BB koncentration av 0,1 mM i PBS-G.
- Deposition 8 nl droppar av dessa rena och blandade lösningar på prismaytan med hjälp av en beröringsfri spotter i fyra exemplar för varje grad med 44 platser i totalt (figur 2).
OBS: 10% glycerol tillsattes i PBS-G är mycket viktigt för att minska lösningsmedelsavdunstning och förändringen av BB koncentration efter avsättning. - Placera prismat i en petriskål med 1 ml ultrarent vatten och låt den O / N vid RT för självmontering av BB1 och BB2 på guldytan. Häri antas det att den genomsnittliga ytan kompositionen i det blandade SAM reflekterar sammansättningen av deponerings blandad lösning (Figur 3) 11.
- Tvätta noggrant prismat med ultrarent vatten och torka den under ett flöde av argon.
3 Protein Sensing från Spri
- Ställ incubator i vilken Spri anordning placeras vid 25 ° C för att undvika brytningsindexförändringar induceras genom temperaturvariation under proteinanalys.
- Sätt i ett icke-funktionskölj prisma i 10 pl polyetereterketon (PEEK) flödescell kopplad till en datorstyrd sprutpump, en avgasnings och en 6-port medeltryck insprutningsventil (Figur 4). Fyll i systemflödet med färsk filtreras och avgasas rinnande buffert HEPES.
- Avlägsna skölj prisma och infoga prismat innehållande CoCRR arrayen i flödescellen. Kör HEPES på 100 l / min flöde. Med hjälp av CCD-kameran avlägsna eventuella luftbubblor som är närvarande på den prismaytan genom att passera löpbuffert snabbt.
- Definiera studieområde för varje fläck genom att rita en cirkel med samma diameter för det intressanta området bygger på en väl kontrasterade bilden av gruppen och med hjälp av integrerade program i Spri-systemet.
- Trace plasmon kurvor, som representerar reflekterarivity kurvorna i funktion av infallsvinkeln, för alla fläckar.
- Välj arbetsvinkel (position där kinetiska kurvor kommer att registreras) på högsta lutningen på reflexionskurvor. Rotera avsökningsspegeln för att fixera det valda arbetsvinkeln för kinetiska mätningar.
- Fortsätt att köra HEPES genom systemet flödet tills reflektionssignal för alla fläckar är stabil och konstant.
- Injicera 1 ml AHL-lösning med en spruta in i provslingan (500 l) med injektionsventilen i läge "last". Lägg sedan insprutningsventilen i läge "injektion". Flödet används för alla protein injektion var 100 l / min.
- Börja kinetiska mätningar genom att övervaka reflexionsvariationer mot tiden samtidigt på alla ställen.
- Vid slutet av protein injektion, skölj arrayen med rinnande buffert under 8 min. Slutligen injicera en ml 1% SDS för att regenerera den.
- Upprepa samma procedur för den andra proteins.
4 databehandling och analys
- Efter införandet av proteinlösningen i flödescellen, molekylär bindning sker och inducerar en förskjutning av plasmon kurvorna och en variant av reflektionsförmåga. Den bild förvärv programvara omvandlar de uppmätta ljusstyrkevärdena för gråskalenivåer, vilket ger SPR bilder Figur 5A, och genererar variationen av reflektivitet mot tiden, vilket ger sensorgrammen (Figur 5B).
- Använd en matte computing programvara för att rita reflexionsförmågan (R%) i slutet av varje protein injektion kontra [BB1] / ([BB1] + [BB2]) förhållandet att generera 2D kontinuerlig evolution profil (CEP) för varje prov (Figur 5C).
- Tillsätt [BB1] / ([BB1] + [BB2]) förhållandet i sensorgrammen (figur 5B) för att generera 3D kontinuerlig evolution liggande (CEL) för varje protein (figur 5D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att undersöka möjligheten för elektronisk tunga för vanliga proteinanalys, har tre proteiner som används: AHL, myoglobin och lysozym. För varje protein, en distinkt 2D kontinuerlig evolution profil, CEP, genererades av ET, som visas i figur 6.
Dessutom, tack vare Spri, som är i stånd att övervaka i realtid adsorption och desorption kinetik, för varje protein en tidsberoende kontinuerliga igenkänningsmönster, kallat 3D kontinuerlig evolution liggande (CEL), genererades. I figur 7, är karakteristiska Cels av dessa tre proteiner visas.
Figur 1 Kemiska strukturer för de två byggstenar som används i detta protokoll för att förbereda CoCRR array.51901 / 51901fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 Ett foto av ett prisma efter avsättning av 44 droppar av de rena och blandade lösningar av BB1 och BB2 med användning av en beröringsfri piezoelektriska spotter med varje förhållande i fyra exemplar. Prismat placerades intill ett Eppendorf-rör av 1,5 ml.
Figur 3 Schematisk illustration av CoCRR array som innehåller 11 differential receptorer som framställdes med rena och blandade lösningar av BB1 och BB2 vid olika förhållanden och låta blandningarna till själv montera på guld suryta av prismat.
Figur 4 Schematisk illustration av Spri detektionssystem i kombination med en mikroflödessystem.
Figur 5 Schematisk illustration av data behandling för generering av två typer av fortlöpande erkännande mönster med utvecklad elektronisk tunga: 2D kontinuerlig evolution profil och 3D ständig utveckling landskapet.
Figur 6. Continuous evolution profiler för tre rena proteiner:. AHL (500 nM), myoglobin (1 M) och lysozym (500 nM) De genererades genom att plotta variationen av reflexionsförmågan (R%) i slutet av proteininjektion kontra [BB1 ] / ([BB1] + [BB2]) förhållande.
Figur 7 Landskap smak: karakteristiska 3D Cels i AHL, myoglobin och lysozym genereras av elektronisk tunga.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mest kritiska stegen för konstruktion av denna eT är dedikerade för att säkerställa god reproducerbarhet av systemet. Till exempel för att rengöra guldytan av prismat med ett standardiserat förfarande före användning, lägga 10% av glycerol i de elva rena och blandade lösningar av BB1 och BB2 eliminera lösningsmedelsavdunstning under BBs självorganiserande på guldytan av prismat, deponera flera replikat för varje [BB1] / ([BB1] + [BB2]) ratio osv. När det gäller protein avkänning av SPRI, är valet av den arbetsvinkel kritisk. Vanligtvis är den fast vid den högsta lutningen reflektiviteten kurvor. Dessutom är det mycket viktigt att använda standardiserade experimentella betingelser för varje proteinanalys, såsom arbetstemperatur, flödeshastighet osv. Efter varje protein injektion måste CoCRR array regenereras för återanvändning med en lämplig lösning som gör att fullständig regenerering av systemet utan några skador på receptorer.
e_content "> För att visa att den utvecklade eT är inte bara effektivt för studier av sockerbindande proteiner som tidigare rapporterats 9, men också för vanliga proteiner, en lektin AHL tillsammans med två icke-sockerbindande proteiner myoglobin och lysozym användes. De valdes för att ha en mängd olika avgifter i HEPES (pH 7,4):. AHL (isoelektrisk punkt (pl) 6,0), myoglobin (pl 7,2) och lysozym (pl 11) Särskilt, såsom visas i fig 6, varvid varje protein har ett unikt svarsmönster. AHL är något negativt laddad i HEPES. Dess CEP visar att den har bättre samspel med de negativt laddade BB2 rika CoCRRs. Troligtvis är det på grund av samspelet mellan den positivt laddade domänen av proteinet och BB2-rika CoCRRs . För myoglobin, som är globalt neutrala i HEPES, det finns inte mycket skillnad mellan signaler som erhålls med alla CoCRRs. Vid en jämförelse myoglobin i CEP till CEPS i AHL och lysozym, även vid en högre koncentration signalen är mycket lower. Såsom för lysozym, som är positivt laddad i HEPES, var den maximala signal som erhålls med CoCRR innehållande ren BB2.Tack vare fördelarna med Spri kan övervaka i realtid adsorption och desorptionskinetiktestet, för varje protein en 3D kontinuerlig evolution landskap skapades. Denna typ av tidsberoende igenkänningsmönstret ger kompletterande differentieringsparametrar för proteinanalys. I synnerhet skulle det vara mycket användbart för att analysera två analyter som utgör den liknande affinitet för en uppsättning CoCRRs men skiljer sig i deras kinetik av interaktion. Såsom visas i fig 7, de Cels är lätt urskiljbara. Dessa resultat visar att interaktionen av de tre proteinerna med de CoCRRs är beroende av sina ytegenskaper såsom fördelningen av hydrofoba, neutrala och laddade aminosyrarester. Både CEP och CEL kan användas som "fingeravtryck" för diskriminering protein och Prospectiv identifiering. Således är eT effektiv för analys av vanliga proteiner.
Protokollet som beskrivs häri använder ett kombinatoriskt tillvägagångssätt för att konstruera eT för proteinanalys. Till skillnad från andra metoder som använder ett antal molekyler som är strukturellt komplicerade och arbetskrävande att syntetisera, var bara två små molekyler som används för att framställa den korsreaktiva receptor array förmåga att differentiera proteiner med bra upplösning i föreliggande studie. Dessutom, enligt den tidigare undersökningen, är eT stabil, reproducerbar och åter 9. Dessutom Spri tillåter övervakning bindande händelser i realtid och generera nya kontinuerliga igenkänningsmönster med oöverträffad tillförlitlighet. Inom en snar framtid kommer ytterligare BBs med kompletterande fysikalisk-kemiska egenskaper införas för att öka mångfalden i CoCRR i matriser för analys av komplexa blandningar i flytande eller gas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SPRi apparatus | Horiba Scientific-GenOptics | SPRi apparatus is placed in a temperature regulated incubator at 25 °C. | |
| Incubator | Memmert | ||
| Syringe pump | Cavro scientific instruments | Cavro XLP 6000 | |
| Micro Elite Degasser | Alltech | AT590507 | |
| 6-port medium pressure injection valve | Upchurch Scientific | The volume of injection loop used is 500 µl. | |
| Femto plasma cleaner (version 7) | Diener Electronic | On-line degassing system with 2 channel. | |
| Spotter | Siliflow | It is a non-contact piezoelectric spotter. | |
| SPRi-Biochip | Horiba Scientific-GenOptics | 36000067 | The prism is made of a high refractive index glass prism coated with a thin gold film (45 nm) and specially developed for imaging purposes. |
| Erythrina cristagalli lectin | Sigma-Aldrich | L5390 | |
| Arachis hypogaea lectin | Sigma-Aldrich | L0881 | |
| Myoglobin | Sigma-Aldrich | M1882 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| CXCL12α | Provided by Dr. Hugues Lortat-Jacob; for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| CXCL12γ | Provided by Dr. Hugues Lortat-Jacob; for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| Lactose | Provided by Prof. David Bonnaffé; for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| Sulfated lactose | Provided by Prof. David Bonnaffé; for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 |
References
- Margulies, D., Hamilton, A. D. Combinatorial protein recognition as an alternative approach to antibody-mimetics. Current Opinion in Chemical Biology. 14, 705-712 (2010).
- Umali, A. P., Anslyn, E. V. A general approach to differential sensing using synthetic molecular receptors. Current Opinion in Chemical Biology. 14, 685-692 (2010).
- Baldini, L., Wilson, A. J., Hong, J., Hamilton, A. D. Pattern-based detection of different proteins using an array of fluorescent protein surface receptors. J. Am. Chem. Soc. 126, 5656-5657 (2004).
- Zhou, H. C., Baldini, L., Hong, J., Wilson, A. J., Hamilton, A. D. Pattern recognition of proteins based on an array of functionalized porphyrins. J. Am. Chem. Soc. 128, 2421-2425 (2006).
- Wright, A. T., Griffin, M. J., Zhong, Z., McCleskey, S. C., Anslyn, E. V., McDevitt, J. T. Differential receptors create patterns that distinguish various proteins. Angew. Chem. Int. Ed. 44, 6375-6378 (2005).
- Wright, A. T., Anslyn, E. V. Differential receptor arrays and assays for solution-based molecular recognition. Chem. Soc. Rev. 35, 14-28 (2006).
- You, C. C., et al. Detection and identification of proteins using nanoparticle–fluorescent polymer ‘chemical nose’ sensors. Nature Nanotechnology. 2, 318-323 (2007).
- De, M., et al. Sensing of proteins in human serum using conjugates of nanoparticles and green fluorescent protein. Nature Chemistry. 1, 461-465 (2009).
- Hou, Y., et al. Continuous evolution profiles for electronic-tongue-based analysis. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 10394-10398 (2012).
- Campbell, C. T., Kim, G. SPR microscopy and its applications to high-throughput analyses of biomolecular binding events and their kinetics. Biomaterials. 28, 2380-2392 (2007).
- Stranick, S. J., et al. Nanometer-scale phase separation in mixed composition self-assembled monolayers. Nanotechnology. 7, 438-442 (1996).
