Elektronisk Tunge Generering Kontinuerlige Mønstre anerkendelse for Protein Analyse
Summary
A novel approach is described for construction of electronic tongue (eT), which greatly simplifies the design and production of sensing materials, and allows the eT to generate continuous evolution profiles and landscapes for samples in liquid. The obtained eT is efficient for common protein analysis such as discrimination.
Abstract
In current protocol, a combinatorial approach has been developed to simplify the design and production of sensing materials for the construction of electronic tongues (eT) for protein analysis. By mixing a small number of simple and easily accessible molecules with different physicochemical properties, used as building blocks (BBs), in varying and controlled proportions and allowing the mixtures to self-assemble on the gold surface of a prism, an array of combinatorial surfaces featuring appropriate properties for protein sensing was created. In this way, a great number of cross-reactive receptors can be rapidly and efficiently obtained. By combining such an array of combinatorial cross-reactive receptors (CoCRRs) with an optical detection system such as surface plasmon resonance imaging (SPRi), the obtained eT can monitor the binding events in real-time and generate continuous recognition patterns including 2D continuous evolution profile (CEP) and 3D continuous evolution landscape (CEL) for samples in liquid. Such an eT system is efficient for discrimination of common purified proteins.
Introduction
Præcise og hurtige protein sensing metoder er meget vigtige i medicinsk diagnostik og proteomics. Klassiske protein-afsløring arrays, såsom biochips, er baseret på princippet om "lock-and-key" anerkendelse og kræver specifikke receptorer, såsom aptamerer, antistoffer eller mimetika.
I de seneste år har forskellen sensing inspireret af den menneskelige lugtesans og gustation opstået som et alternativ 1. Denne elektroniske næse / tunge (EN / ET) tilgang er baseret på forskellen binding af analytter til en række krydsreaktive receptorer (CRRs), der ikke behøver at være meget specifik eller selektiv for målmolekylerne således gøre det muligt at overvinde den møjsommelige processen med at udvikle højselektive receptorer. Det er den kombinerede indsats af alle de receptorer, der skaber et tydeligt mønster for hver prøve, som et fingeraftryk, så dets identifikation.
De to centrale udfordringer for udviklingen af elektronic næse / tunge til effektiv protein sensing er produktionen af følerelementer, der har evnen til at skelne mellem strukturelt tilsvarende analytter og passende transduktion for bindingsbegivenheden. Hidtil har undersøgelser indberettet forskellige tilgange til opstilling udvikling 2. For eksempel i en undersøgelse et array-baserede identifikation af proteiner blev udviklet ved hjælp CRRs fremstillet ud fra tetra-carboxyphenylporphyrin derivater ved at koble carboxylgrupperne til forskellige aminosyrer eller dipeptider at give differentierede receptorer besidder en hydrofob kerne til affinitet for proteiner og forskellige ladede periferier for bibringe differentiel binding. Ved hjælp af dette system blev forskellige proteiner og proteinblandinger identificeret ved måling af fluorescens bratkøling af receptorerne ved interaktion med analytterne 3,4. I en anden undersøgelse, et bibliotek af 29 CRRs indeholdende tripeptid og boronsyre dele syntetiseret i en kombinatorisk måde på en hexasubstiindstiftede benzen stillads blev udviklet til at føle proteiner med en indikator-uptake kolorimetrisk detektion 5,6. Med en sådan udformning, hver receptoren viste forskellen bindingskapacitet med proteiner baseret på variansen i peptid-arme, og boronsyrer bistået i differentiering af proteiner fra glycoproteiner. På det seneste har en række sammensat af forskellige kationiske funktionaliserede guld nanopartikler konjugeret med en anionisk fluorescerende polymer poly (p-phenyleneethynylene) (PPE) blevet oprettet for at registrere og identificere proteiner 7. Konkurrencesituationen binding mellem protein analytter og standset PPE / guld nanopartikler komplekser regenererede fluorescens, der producerer forskellige mønstre anerkendelse for proteiner. I denne undersøgelse blev de funktionaliserede nanopartikel-protein interaktioner tunet af varierende fysisk-kemiske egenskaber nanopartikel endegrupper. Endvidere blev det vist, at denne fremgangsmåde er effektiv til proteinanalyse i komplekse og proteinrigt medium, såsomsom human serum ved fysiologisk relevante koncentrationer, hvilket viser potentialet i eT i at profilere ægte prøver til diagnosticering af sygdomstilstande 8.
Selvom meget lovende, disse systemer har nogle iboende begrænsninger. De kræver at designe og syntetisere 5-29 CRRs med ganske komplicerede strukturer. Derudover, i modsætning til det olfaktoriske system, der nulstilles efter hver måling, protein sensing kræver fremstilling af en række per prøve. Endelig er ekstremt vanskelige overvågning realtid bindende begivenheder.
I denne forbindelse blev en kombinatorisk foreslåede tilgang ved hjælp af et lille antal simple og let tilgængelige molekyler med forskellige fysisk-kemiske egenskaber (hydrofile, hydrofobe, positivt ladede, negativt ladet, neutralt etc.) Som byggesten BBS () 9. Ved at blande BBs i varierende og kontrollerede forhold og lade blandingerne til selv at samle på guld overfladen af enprisme, blev en række kombinatoriske overflader byder passende egenskaber til bindende protein oprettet. Især selvstændige samlet monolag på dette system tillader nem indstilling af en række overfladeegenskaber i en meget divergerende måde, så forskellige kombinatoriske krydsreaktive receptorer (CoCRRs) for at være hurtigt og effektivt produceret. Protein sensing blev udført under anvendelse af et optisk detektionssystem overflade plasmon resonans (SPRI). Kort fortalt en bred stråle monokromatisk polariseret lys fra en LED lyser hele CoCRR matrix område på overfladen af prisme. En høj opløsning CCD-videokamera giver real-Tidsforskel billeder på tværs af alle de pletter af CoCRR array. Det fanger alle de lokale ændringer på overfladen af CoCRR vifte med detaljerede oplysninger om bindende begivenheder og kinetiske processer 10. I mellemtiden, med hjælp af imaging software, SPR billeder svarende til pletter konverteres automatisk til variationer af refleksivitet Versus tid, genererer en række kinetiske bindingskurver kaldet sensorgrams. Således Spri tillader en etiket-fri, synkron, parallel og real-time observation af bindende begivenheder. Derudover opnåede CoCRR array er regenererbar og genbruges til proteinanalyse.
Denne protokol beskriver konstruktionen af det elektroniske tungen ved hjælp af kun to små molekyler som byggesten og illustrerer dens anvendelse til analyse af almindelige proteiner baseret på endeløse mønstre anerkendelse opnået med Spri.
Protocol
Representative Results
Discussion
De mest kritiske trin til konstruktion af denne eT er dedikeret til at sikre en god reproducerbarhed af systemet. For eksempel at rense guld overflade prisme med en standardiseret procedure før brug, tilsætning af 10% glycerol i de elleve rene og blandede opløsninger af BB1 og BB2 fjerne opløsningsmiddel fordampning under skuds selvsamlende på guldoverfladen af prismen deponering af flere gentagelser for hver [BB1] / ([BB1] + [BB2]) forhold mv. Med hensyn til protein-sensing af Spri, valget af …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Ph.D. grant of LANEF in Grenoble for support of Laurie-Amandine Garçon. This work was financially supported by the French National Research Agency (ANR-grant 06-NANO-045).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| SPRi apparatus | Horiba Scientific-GenOptics | SPRi apparatus is placed in a temperature regulated incubator at 25°C. | |
| Incubator | Memmert | ||
| Syringe pump | Cavro scientific instruments | Cavro XLP 6000 | |
| Micro Elite Degasser | Alltech | AT590507 | |
| 6-port medium pressure injection valve | Upchurch Scientific | The volume of injection loop used is 500 µl. | |
| Femto plasma cleaner (version 7) | Diener Electronic | On-line degassing system with 2 channel. | |
| Spotter | Siliflow | It is a non-contact piezoelectric spotter. | |
| SPRi-Biochip | Horiba Scientific-GenOptics | 36000067 | The prism is made of a high refractive index glass prism coated with a thin gold film (45 nm) and specially developed for imaging purposes. |
| erythrina cristagalli lectin | Sigma-Aldrich | L5390 | |
| arachis hypogaea lectin | Sigma-Aldrich | L0881 | |
| myoglobin | Sigma-Aldrich | M1882 | |
| lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| CXCL12α | Provided by Dr. Hugues Lortat-Jacob, for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| CXCL12γ | Provided by Dr. Hugues Lortat-Jacob, for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| lactose | Provided by Prof. David Bonnaffé, for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| sulfated lactose | Provided by Prof. David Bonnaffé, for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| tween 20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 |
Riferimenti
- Margulies, D., Hamilton, A. D. Combinatorial protein recognition as an alternative approach to antibody-mimetics. Current Opinion in Chemical Biology. 14, 705-712 (2010).
- Umali, A. P., Anslyn, E. V. A general approach to differential sensing using synthetic molecular receptors. Current Opinion in Chemical Biology. 14, 685-692 (2010).
- Baldini, L., Wilson, A. J., Hong, J., Hamilton, A. D. Pattern-based detection of different proteins using an array of fluorescent protein surface receptors. J. Am. Chem. Soc. 126, 5656-5657 (2004).
- Zhou, H. C., Baldini, L., Hong, J., Wilson, A. J., Hamilton, A. D. Pattern recognition of proteins based on an array of functionalized porphyrins. J. Am. Chem. Soc. 128, 2421-2425 (2006).
- Wright, A. T., Griffin, M. J., Zhong, Z., McCleskey, S. C., Anslyn, E. V., McDevitt, J. T. Differential receptors create patterns that distinguish various proteins. Angew. Chem. Int. Ed. 44, 6375-6378 (2005).
- Wright, A. T., Anslyn, E. V. Differential receptor arrays and assays for solution-based molecular recognition. Chem. Soc. Rev. 35, 14-28 (2006).
- You, C. C., et al. Detection and identification of proteins using nanoparticle–fluorescent polymer ‘chemical nose’ sensors. Nature Nanotechnology. 2, 318-323 (2007).
- De, M., et al. Sensing of proteins in human serum using conjugates of nanoparticles and green fluorescent protein. Nature Chemistry. 1, 461-465 (2009).
- Hou, Y., et al. Continuous evolution profiles for electronic-tongue-based analysis. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 10394-10398 (2012).
- Campbell, C. T., Kim, G. SPR microscopy and its applications to high-throughput analyses of biomolecular binding events and their kinetics. Biomaterials. 28, 2380-2392 (2007).
- Stranick, S. J., et al. Nanometer-scale phase separation in mixed composition self-assembled monolayers. Nanotechnology. 7, 438-442 (1996).
