Lingua elettronica Generazione di modelli continui di rilevazione delle analisi delle proteine
Summary
A novel approach is described for construction of electronic tongue (eT), which greatly simplifies the design and production of sensing materials, and allows the eT to generate continuous evolution profiles and landscapes for samples in liquid. The obtained eT is efficient for common protein analysis such as discrimination.
Abstract
In current protocol, a combinatorial approach has been developed to simplify the design and production of sensing materials for the construction of electronic tongues (eT) for protein analysis. By mixing a small number of simple and easily accessible molecules with different physicochemical properties, used as building blocks (BBs), in varying and controlled proportions and allowing the mixtures to self-assemble on the gold surface of a prism, an array of combinatorial surfaces featuring appropriate properties for protein sensing was created. In this way, a great number of cross-reactive receptors can be rapidly and efficiently obtained. By combining such an array of combinatorial cross-reactive receptors (CoCRRs) with an optical detection system such as surface plasmon resonance imaging (SPRi), the obtained eT can monitor the binding events in real-time and generate continuous recognition patterns including 2D continuous evolution profile (CEP) and 3D continuous evolution landscape (CEL) for samples in liquid. Such an eT system is efficient for discrimination of common purified proteins.
Introduction
Metodi di rilevamento proteine precisi e rapidi sono molto importanti nella diagnostica medica e della proteomica. Array di proteine rilevamento classici, come biochip, si basano sul "tasto lock-e-" principio di riconoscimento e richiedono recettori specifici come aptameri, anticorpi, o mimetici.
Negli ultimi anni, il rilevamento differenziale ispirato alla olfatto umano e gustation è emerso come alternativa 1. Questo naso elettronico / lingua (/ eT eN) approccio si basa sul legame di analiti ad una serie di recettori cross-reattivi (CRRS), che non hanno bisogno di essere altamente specifico e selettivo per le molecole target differenziale permettere così a superare il laborioso processo di sviluppo di recettori altamente selettivi. È la risposta combinata di tutti i recettori che crea un modello distinto per ogni campione, come un'impronta digitale, permettendo la sua identificazione.
Le due sfide fondamentali per lo sviluppo di elettronic naso / lingua per il rilevamento della proteina efficace sono la produzione di elementi sensibili che hanno la capacità di distinguere tra analiti strutturalmente simili e il sistema di trasduzione appropriata per l'evento vincolante. Fino ad oggi, gli studi hanno riportato vari approcci allo sviluppo di matrice 2. Ad esempio, in uno studio di una identificazione basata su array di proteine è stato sviluppato utilizzando CRRS preparati derivati tetra-carboxyphenylporphyrin accoppiando i gruppi carbossilici ai vari amminoacidi o dipeptidi per fornire recettori differenziali in possesso di un nucleo idrofobico per affinità con le proteine e periferie cariche distinte per impartire differenziale vincolante. Utilizzando questo sistema, diverse proteine e miscele proteiche sono stati identificati mediante misurazione della fluorescenza dei recettori seguito all'interazione con gli analiti 3,4. In un altro studio, una biblioteca di 29 CRRS contenenti tripeptide e frazioni di acido boronici sintetizzato in modo combinatorio su una hexasubstistituito patibolo benzene è stato sviluppato per il rilevamento di proteine con un rilevamento colorimetrico indicatore-assorbimento 5,6. Con un tale disegno, ogni recettore ha mostrato capacità di legame differenziale con le proteine in base alla varianza tra le braccia peptide, e gli acidi boronici assistiti nella differenziazione delle proteine da glicoproteine. Più di recente, una serie composta da diversi cationici funzionalizzati nanoparticelle d'oro coniugati con un poli anionico polimero fluorescente (p-phenyleneethynylene) (PPE) è stato creato per rilevare ed identificare le proteine 7. Il legame concorrenziale tra analiti proteici e bonificato PPE / oro complessi nanoparticelle artificiali fluorescenza, producendo modelli di riconoscimento distinti per le proteine. In questo studio, le interazioni proteina-nanoparticelle funzionalizzate sono stati sintonizzati variando le proprietà fisico-chimiche dei gruppi terminali nanoparticelle. Inoltre, è stato dimostrato che questo approccio è efficace per l'analisi delle proteine in complessi e proteine ricche supporto, adcome siero umano a concentrazioni fisiologicamente rilevanti, mostrando in tal modo il potenziale di eT in profilatura campioni reali per la diagnosi di stati di malattia 8.
Anche se molto promettente, questi sistemi hanno alcune limitazioni intrinseche. Essi richiedono la progettazione e la sintesi di 5-29 CRRS con strutture molto complesse. Inoltre, a differenza del sistema olfattivo che è resettato dopo ciascuna misurazione, rilevamento proteina richiede la preparazione di una matrice per campione. Infine, monitoraggio eventi vincolanti in tempo reale sono estremamente difficili.
In questo contesto, un approccio combinatorio è stato proposto con un piccolo numero di molecole semplici e facilmente accessibili con diverse proprietà fisico-chimiche (idrofili, idrofobici, carica positiva, carica negativa, neutra, ecc.) Come blocchi da costruzione (BBS) 9. Mescolando bbs di variabili e proporzioni controllate e permettendo le miscele di auto-assemblarsi sulla superficie d'oro di unprisma, una vasta gamma di superfici combinatorie che caratterizzano le proprietà appropriate per la proteina di legame è stato creato. In particolare, i monostrati auto-assemblati su questo sistema consentono una facile messa a punto di una serie di proprietà di superficie in modo altamente divergente, consentendo diversi recettori cross-reattivi combinatorie (CoCRRs) per essere prodotta rapido ed efficiente. Rilevamento delle proteine è stata effettuata utilizzando un sistema di rilevamento ottico, risonanza plasmonica di superficie per immagini (SPRI). Brevemente, un ampio fascio monocromatico luce polarizzata da un LED illumina l'intera area matrice CoCRR sulla superficie del prisma. Una videocamera CCD ad alta risoluzione offre immagini di differenza in tempo reale in tutti i punti della matrice CoCRR. Cattura tutte le modifiche locali alla superficie della matrice CoCRR fornire informazioni dettagliate sugli eventi di legame e processi cinetici 10. Nel frattempo, con l'aiuto di software di imaging, immagini SPR corrispondenti a punti vengono convertiti automaticamente alle variazioni di riflettività versus tempo, generando una serie di curve cinetiche di legame chiamato sensorgrams. Così, SPRI permette un'osservazione, sincrono, in parallelo, privo di etichetta e in tempo reale degli eventi vincolanti. Inoltre, la matrice CoCRR ottenuto è rigenerabile e riutilizzabile per analisi delle proteine.
Questo protocollo descrive la costruzione della lingua elettronica utilizzando solo due piccole molecole come blocchi di costruzione e illustra la sua applicazione per l'analisi delle proteine comuni basate su modelli di riconoscimento continui ottenuti con spri.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le fasi più critiche per la costruzione di questa eT sono dedicati per garantire una buona riproducibilità del sistema. Ad esempio, la pulizia della superficie d'oro del prisma con una procedura standardizzata prima dell'uso, aggiungendo il 10% di glicerolo nelle undici soluzioni puri e misti di BB1 e BB2 per eliminare l'evaporazione del solvente durante BB autoassemblante sulla superficie di oro del prisma, depositando più replicati per ogni [BB1] / ([BB1] + [BB2]) rapporto, ecc. Come per …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Ph.D. grant of LANEF in Grenoble for support of Laurie-Amandine Garçon. This work was financially supported by the French National Research Agency (ANR-grant 06-NANO-045).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| SPRi apparatus | Horiba Scientific-GenOptics | SPRi apparatus is placed in a temperature regulated incubator at 25°C. | |
| Incubator | Memmert | ||
| Syringe pump | Cavro scientific instruments | Cavro XLP 6000 | |
| Micro Elite Degasser | Alltech | AT590507 | |
| 6-port medium pressure injection valve | Upchurch Scientific | The volume of injection loop used is 500 µl. | |
| Femto plasma cleaner (version 7) | Diener Electronic | On-line degassing system with 2 channel. | |
| Spotter | Siliflow | It is a non-contact piezoelectric spotter. | |
| SPRi-Biochip | Horiba Scientific-GenOptics | 36000067 | The prism is made of a high refractive index glass prism coated with a thin gold film (45 nm) and specially developed for imaging purposes. |
| erythrina cristagalli lectin | Sigma-Aldrich | L5390 | |
| arachis hypogaea lectin | Sigma-Aldrich | L0881 | |
| myoglobin | Sigma-Aldrich | M1882 | |
| lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| CXCL12α | Provided by Dr. Hugues Lortat-Jacob, for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| CXCL12γ | Provided by Dr. Hugues Lortat-Jacob, for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| lactose | Provided by Prof. David Bonnaffé, for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| sulfated lactose | Provided by Prof. David Bonnaffé, for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| tween 20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 |
Riferimenti
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