gDNA arricchimento da una tecnologia basata trasposasi-NGS per l'analisi della sequenza intera<em> BRCA1</em>,<em> BRCA2</em>, e 9 geni coinvolti nella riparazione del DNA Damage
Summary
gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.
Abstract
L'uso diffuso di Next Generation Sequencing ha aperto nuove strade per la ricerca sul cancro e la diagnosi. NGS porterà enormi quantità di nuovi dati sul cancro, e soprattutto la genetica del cancro. Le conoscenze attuali e future scoperte renderà necessario studiare un gran numero di geni che potrebbero essere coinvolti in una predisposizione genetica al cancro. A questo proposito, abbiamo sviluppato un progetto Nextera per studiare 11 geni completi coinvolti nella riparazione del DNA danni. Questo protocollo è stato sviluppato per studiare in modo sicuro 11 geni (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, e TP53) dal promotore a 3'-UTR in 24 pazienti contemporaneamente. Questo protocollo, basato sulla tecnologia trasposasi e gDNA arricchimento, dà un grande vantaggio in termini di tempo per la diagnosi genetica grazie a campione multiplexing. Questo protocollo può essere utilizzato in modo sicuro con gDNA sangue.
Introduction
Nel 2010, quasi 1,5 milioni di persone (essenzialmente donne) hanno sviluppato il cancro al seno in tutto il mondo. Si stima che dal 5 al 10% di questi casi erano ereditarie. Quasi 20 anni fa, BRCA1 e BRCA2 sono stati identificati come coinvolti in seno ereditario e tumori ovarici 1. Da circa 15 anni fa, BRCA1 e BRCA2 regioni codificanti sono stati sequenziati per determinare la predisposizione genetica al cancro della mammella e dell'ovaio. Alterazioni in BRCA1 e BRCA2 sono rilevati in 10 al 20% delle famiglie selezionate 2 suggeriscono che l'analisi di queste regioni non è sufficiente per lo screening efficace. Recentemente, l'analisi di sequenze non codificanti (introni, promotore, 3-'UTR) di BRCA1 e BRCA2 ha sottolineato che le nuove mutazioni / varianti potrebbero essere collegati ad un più elevato rischio di cancro al seno 3-6.
Proteine BRCA1 e BRCA2 sono coinvolti nella ricombinazione omologa Repair (HHR), che è completato da numerosi partner 7. Mentre le alterazioni in BRCA1 o BRCA2 indurre difetti nella riparazione del DNA, gli altri partner possono anche influenzare il rischio di cancro al seno. Questa ipotesi sembra essere stato convalidato dal BRIP1 8 e 9 PALB2 avere un impatto provato sul cancro del collo dell'utero e della mammella, rispettivamente. Inoltre, due altri geni di suscettibilità "rischio moderato" cancro al seno, ATM e CHEK2, possono anche essere studiati sistematicamente 10.
A seguito di questi studi, abbiamo deciso di sviluppare un protocollo per l'analisi di 11 geni (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, rad50, RAD51C, RAP80, e TP53) in 24 pazienti simultaneamente utilizzando un programma molto semplice e relativamente protocollo veloce basato sulla tecnologia trasposasi, con l'arricchimento e il sequenziamento su un dispositivo di throughput medio. Graziea questa tecnica, abbiamo sequenziato i geni completi dall'inizio del promotore al fine di 3'-UTR, tranne RAP80, per cui una regione intronic di 2.500 bp non era coperto (Chr5: 176,381,588-176,390,180). Questo rappresenta un totale di circa 1.000.300 bp studiato con 2.734 sonde. Di solito, BRCA1 e BRCA2 sequenze exonic vengono analizzati da Sanger sequenziamento, che ha bisogno di 1,5 mesi per meno di 20 pazienti. Con la presente protocollo (Figura 1), nello stesso tempo, 11 geni completi per più di 75 pazienti potrebbero essere analizzati.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'uso diffuso di dispositivi e tecnologie NGS ha fornito nuove opportunità nello studio dei tumori e malattie genetiche. Oltre al sequenziamento dell'intero genoma o RNA sequenziamento, l'analisi di una grande quantità di sequenze di gDNA selezionati in numerosi pazienti contemporaneamente offre grandi prospettive nella diagnosi. Qui, abbiamo sviluppato uno specifico progetto (disponibile su richiesta), utilizzando la tecnologia Nextera per studiare 11 geni completi in 24 pazienti contemporaneamente con un…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Ligue contre le Cancer de Côte d’Or and the Centre Georges-François Leclerc for their financial support. We thank Philip Bastable for the editing of the manuscript.
Materials
| MiSeq | Illumina | SY-410-1001 | Sequencing/medium throughput device |
| Nextera Enrichment kit | Illumina | FC-123-1208 | Transposase based technology |
| 300 cycle cartridge | Illumina | 15033624 | |
| AMPure beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic purification beads |
| Magnetic stand | Alpaqua | A32782 | |
| 96-well plates | Life Technologies | 4306737 | |
| MIDI 96-well plates | Biorad | AB0859 | |
| Microseal A | Biorad | MSA-5001 | This seal is necessary only for PCR amplification. Other standard seals can be used throughout the experiment |
| MiSeq | Illumina | Provided with the sequencing device Experiment Manager software |
|
| Illumina | Internet adress: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new> Manufacturer website tool |
Riferimenti
- Cornelisse, C. J., Cornelis, R. S., Devilee, P. Genes responsible for familial breast cancer. Pathol. Res. Pract. 192 (7), 684-693 (1996).
- Culver, J., Lowstuter, K., Bowling, L. Assessing breast cancer risk and BRCA1/2 carrier probability. Breast Dis. 27, 5-20 (2007).
- Cox, D. G., et al. Common variants of the BRCA1 wild-type allele modify the risk of breast cancer in BRCA1 mutation carriers. Hum. Mol. Genet. 20 (23), 4732-4747 (2011).
- Maia, A. T., et al. Effects of BRCA2 cis-regulation in normal breast and cancer risk amongst BRCA2 mutation carriers. Breast Cancer Res. 14 (2), 63 (2012).
- Anczuków, O., et al. BRCA2 deep intronic mutation causing activation of a cryptic exon: opening toward a new preventive therapeutic strategy. Clin. Cancer Res. 18 (18), 4903-4909 (2012).
- Brewster, B. L., et al. Identification of fifteen novel germline variants in the BRCA1 3’UTR reveals a variant in a breast cancer case that introduces a functional miR-103 target site. Hum. Mutat. 33 (12), 1665-1675 (2012).
- Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nat Rev Cancer. 12 (1), 68-78 (2012).
- Ma, X. D., et al. First evidence for the contribution of the genetic variations of BRCA1-interacting protein 1 (BRIP1) to the genetic susceptibility of cervical cancer. Gene. 524 (2), 208-213 (2013).
- Haanpää, M., Pylkäs, K., Moilanen, J. S., Winqvist, R. Evaluation of the need for routine clinical testing of PALB2 c.1592delT mutation in BRCA negative Northern Finnish breast cancer families. BMC Med. Genet. 14, 82 (2013).
- Southey, M. C., Teo, Z. L., Winship, I. PALB2 and breast cancer: ready for clinical translation. Appl. Clin. Genet. 6, 43-52 (2013).
- Ulahannan, D., Kovac, M. B., Mulholland, P. J., Cazier, J. B., Tomlinson, I. Technical and implementation issues in using next-generation sequencing of cancers in clinical practice. Br. J. Cancer. 109, 827-835 (2013).
- Hernan, I., Borràs, E., de Sousa Dias, M., Gamundi, M. J., Mañé, B., Llort, G., Agúndez, J. A., Blanca, M., Carballo, M. Detection of genomic variations in BRCA1 and BRCA2 genes by long-range PCR and next-generation sequencing. J. Mol. Diagn. 14, 286-293 (2012).
- Knierim, E., Lucke, B., Schwarz, J. M., Schuelke, M., Seelow, D. Systematic comparison of three methods for fragmentation of long-range PCR products for next generation sequencing. Plos One. 6, e28240 (2011).
- de Sousa Dias, M., Hernan, I., Pascual, B., Borràs, E., Mañé, B., Gamundi, M. J., Carballo, M. Detection of novel mutations that cause autosomal dominant retinitis pigmentosa in candidate genes by long-range PCR amplification and next-generation sequencing. Mol. Vis. 19, 654-664 (2013).
- . The Breast Cancer Linkage Consortium. Cancer Risks in BRCA2 Mutation Carriers. J. Natl. Cancer Inst. 91, 1310-1316 (1999).
- Levy-Lahad, E., Friedman, E. Cancer risks among BRCA1 and BRCA2 mutation carriers. Br. J. Cancer. 96 (1), 11-15 (2007).
- Risch, H. A., et al. Population BRCA1 and BRCA2 mutation frequencies and cancer penetrances: a kin-cohort study in Ontario, Canada. J. Natl. Cancer Inst. 98 (23), 1694-1706 (2006).
- Slater, E. P., et al. PALB2 mutations in European familial pancreatic cancer families. Clin. Genet. 78, 490-494 (2010).
- Brennan, G. T., Relias, V., Saif, M. W. BRCA and pancreatic cancer. J.O.P. 14 (4), 325-328 (2013).
