gDNA העשרה על ידי טכנולוגיה מבוססת Transposase לניתוח NGS של הרצף השלם של<em> BRCA1</em>,<em> BRCA2</em>, ו -9 גנים המעורבים בתיקון נזק לדנ"א
Summary
gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.
Abstract
השימוש הנרחב בדור הבא של הרצף נפתח אפיקים חדשים לחקר סרטן ואבחון. NGS יביא כמויות עצומות של נתונים חדשים על הסרטן, ובמיוחד סרטן גנטיקה. ידע נוכחי ותגליות עתידיות יעשו את זה צריך ללמוד מספר עצום של גנים שיכולים להיות מעורב בנטייה גנטית לסרטן. בהקשר זה, פיתחנו עיצוב Nextera ללמוד 11 גנים שלמים מעורבים בתיקון נזק לדנ"א. פרוטוקול זה פותח כדי ללמוד בבטחה 11 גנים (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, וTP53) מאמרגן ל3'-UTR ב24 מטופלים בו זמנית. פרוטוקול זה, המבוסס על טכנולוגיית transposase והעשרת gDNA, נותן יתרון גדול במונחים של זמן להודות אבחון הגנטי כדי לדגום ריבוב. פרוטוקול זה ניתן להשתמש בבטחה עם gDNA דם.
Introduction
בשנת 2010, כמעט 1.5 מיליון בני אדם (בעצם נשים) פיתחו סרטן השד ברחבי העולם. ההערכה היא כי 5 עד 10% מהמקרים הללו היו תורשתיים. לפני כמעט 20 שנים, BRCA1 ו BRCA2 זוהו כמעורב בשד תורשתי וסרטן השחלות 1. מאז לפני כ -15 שנים, אזורי קידוד BRCA1 ו BRCA2 היו רצף כדי לקבוע את הנטייה הגנטית לסרטן שד וסרטן השחלה. שינויים בBRCA1 ו BRCA2 מתגלים ב10 עד 20% ממשפחות שנבחרו 2 מצביעים על כך שהניתוח של אזורים אלה אינו מספיק להקרנה יעילה. לאחרונה, ניתוח רצפי קידוד שאינו (אמרגן, אינטרונים, 3-'UTR) של BRCA1 ו BRCA2 הדגיש כי מוטציות חדשות / וריאציות יכולות להיות קשורות לסיכון גבוה יותר לסרטן השד 3-6.
חלבוני BRCA1 ו BRCA2 מעורבים בתיקון הומולוגי רקומבינציה (HHR), אשר הושלם על ידי מספר רב של שותפים 7. בעוד שינויים בBRCA1 או BRCA2 לגרום פגמים בתיקון DNA, שותפים האחרים עשויים גם להשפיע על הסיכון לסרטן השד. השערה זו נראית אומתו מאז BRIP1 8 ויש לי PALB2 9 השפעה מוכחת על סרטן צוואר רחם וסרטן שד, בהתאמה. בנוסף, שני גנים אחרים "מתון בסיכון" לסרטן שד רגישות, כספומט וCHEK2, יכולים להיות גם למדו באופן שגרתי 10.
בהמשך למחקרים הללו, החלטנו לפתח פרוטוקול לנתח 11 גנים (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAP80, וTP53) ב24 מטופלים בו זמנית באמצעות מאוד קל ויחסית פרוטוקול מהיר המבוסס על טכנולוגיית transposase, עם העשרה ורצף על מכשיר תפוקה בינוני. תודהלטכניקה זו, אנו רצף גנים שלמים כבר מההתחלה של האמרגן לסוף 3'-UTR, פרט לRAP80, שאזור intronic של 2,500 נ"ב לא היה מכוסה (Chr5: 176,381,588-176,390,180). זה מייצג כולל של כ 1000300 נ"ב למד עם 2,734 בדיקות. בדרך כלל, רצפי exonic BRCA1 ו BRCA2 מנותחות סנגר רצף, אשר צריך 1.5 חודשים פחות מ 20 חולים. עם הפרוטוקול הנוכחי (איור 1), באותו הזמן, 11 גנים שלמים יותר מ75 חולים יכולים להיות מנותחים.
Protocol
Representative Results
Discussion
השימוש הנרחב במכשירי NGS וטכנולוגיות סיפקו הזדמנויות חדשות בחקר הסרטן והפרעות גנטיות. בנוסף לרצף הגנום כולו או רצף RNA, הניתוח של כמות גדולה של רצפי gDNA נבחרו בחולים רבים בו זמנית מציע סיכויים רבים באבחנה. כאן, פיתחנו עיצוב ספציפי (זמין על פי דרישה) באמצעות טכנולוגיית Nexter…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Ligue contre le Cancer de Côte d’Or and the Centre Georges-François Leclerc for their financial support. We thank Philip Bastable for the editing of the manuscript.
Materials
| MiSeq | Illumina | SY-410-1001 | Sequencing/medium throughput device |
| Nextera Enrichment kit | Illumina | FC-123-1208 | Transposase based technology |
| 300 cycle cartridge | Illumina | 15033624 | |
| AMPure beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic purification beads |
| Magnetic stand | Alpaqua | A32782 | |
| 96-well plates | Life Technologies | 4306737 | |
| MIDI 96-well plates | Biorad | AB0859 | |
| Microseal A | Biorad | MSA-5001 | This seal is necessary only for PCR amplification. Other standard seals can be used throughout the experiment |
| MiSeq | Illumina | Provided with the sequencing device Experiment Manager software |
|
| Illumina | Internet adress: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new> Manufacturer website tool |
Riferimenti
- Cornelisse, C. J., Cornelis, R. S., Devilee, P. Genes responsible for familial breast cancer. Pathol. Res. Pract. 192 (7), 684-693 (1996).
- Culver, J., Lowstuter, K., Bowling, L. Assessing breast cancer risk and BRCA1/2 carrier probability. Breast Dis. 27, 5-20 (2007).
- Cox, D. G., et al. Common variants of the BRCA1 wild-type allele modify the risk of breast cancer in BRCA1 mutation carriers. Hum. Mol. Genet. 20 (23), 4732-4747 (2011).
- Maia, A. T., et al. Effects of BRCA2 cis-regulation in normal breast and cancer risk amongst BRCA2 mutation carriers. Breast Cancer Res. 14 (2), 63 (2012).
- Anczuków, O., et al. BRCA2 deep intronic mutation causing activation of a cryptic exon: opening toward a new preventive therapeutic strategy. Clin. Cancer Res. 18 (18), 4903-4909 (2012).
- Brewster, B. L., et al. Identification of fifteen novel germline variants in the BRCA1 3’UTR reveals a variant in a breast cancer case that introduces a functional miR-103 target site. Hum. Mutat. 33 (12), 1665-1675 (2012).
- Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nat Rev Cancer. 12 (1), 68-78 (2012).
- Ma, X. D., et al. First evidence for the contribution of the genetic variations of BRCA1-interacting protein 1 (BRIP1) to the genetic susceptibility of cervical cancer. Gene. 524 (2), 208-213 (2013).
- Haanpää, M., Pylkäs, K., Moilanen, J. S., Winqvist, R. Evaluation of the need for routine clinical testing of PALB2 c.1592delT mutation in BRCA negative Northern Finnish breast cancer families. BMC Med. Genet. 14, 82 (2013).
- Southey, M. C., Teo, Z. L., Winship, I. PALB2 and breast cancer: ready for clinical translation. Appl. Clin. Genet. 6, 43-52 (2013).
- Ulahannan, D., Kovac, M. B., Mulholland, P. J., Cazier, J. B., Tomlinson, I. Technical and implementation issues in using next-generation sequencing of cancers in clinical practice. Br. J. Cancer. 109, 827-835 (2013).
- Hernan, I., Borràs, E., de Sousa Dias, M., Gamundi, M. J., Mañé, B., Llort, G., Agúndez, J. A., Blanca, M., Carballo, M. Detection of genomic variations in BRCA1 and BRCA2 genes by long-range PCR and next-generation sequencing. J. Mol. Diagn. 14, 286-293 (2012).
- Knierim, E., Lucke, B., Schwarz, J. M., Schuelke, M., Seelow, D. Systematic comparison of three methods for fragmentation of long-range PCR products for next generation sequencing. Plos One. 6, e28240 (2011).
- de Sousa Dias, M., Hernan, I., Pascual, B., Borràs, E., Mañé, B., Gamundi, M. J., Carballo, M. Detection of novel mutations that cause autosomal dominant retinitis pigmentosa in candidate genes by long-range PCR amplification and next-generation sequencing. Mol. Vis. 19, 654-664 (2013).
- . The Breast Cancer Linkage Consortium. Cancer Risks in BRCA2 Mutation Carriers. J. Natl. Cancer Inst. 91, 1310-1316 (1999).
- Levy-Lahad, E., Friedman, E. Cancer risks among BRCA1 and BRCA2 mutation carriers. Br. J. Cancer. 96 (1), 11-15 (2007).
- Risch, H. A., et al. Population BRCA1 and BRCA2 mutation frequencies and cancer penetrances: a kin-cohort study in Ontario, Canada. J. Natl. Cancer Inst. 98 (23), 1694-1706 (2006).
- Slater, E. P., et al. PALB2 mutations in European familial pancreatic cancer families. Clin. Genet. 78, 490-494 (2010).
- Brennan, G. T., Relias, V., Saif, M. W. BRCA and pancreatic cancer. J.O.P. 14 (4), 325-328 (2013).
