Nyre Regeneration i Adult Sebrafisk av Gentamicin Induced Injury

Summary

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

Abstract

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Introduction

Nyrene er avgjørende for fluid homeostase, blodtrykksregulering og filtrering av avfall fra kroppen. Selv om pattedyr er i stand til å reparere eksisterende nephrons etter skade ved bruk av differensierte epitelceller ^1-4, de synes å mangle en pool av reserverte stamceller ⁵ og er ikke i stand til å danne nye nephrons de novo. I motsetning til pattedyr, voksen fisk er i stand til å danne nye nephrons hele voksne liv for å støtte vekst av fisken, og i respons på skade ^6,7. Sebrafisk, Danio rerio, er en uvurderlig modellorganisme for studier av organ regenerering ^8-10 og har potensial til å gi kraftige innsikt i applikasjoner for engineering reparasjon av menneskelige nyrer. Tg (Lhx1a: EGFP) transgenet ¹¹ har vist seg å merke en pool av nevronet progenitorceller i den voksne sebrafisk nyre ^12, men mekanismene som styrer responsen til lhx1a + -celler til å skade rEmain uklart.

Den aminoglykosid gentamicin er en mye brukt antibiotikum med kjente nefrotoksiske og ototoksiske effekter hos mennesker ^13. Intraperitoneal injeksjon av gentamicin er en etablert metode for å indusere akutt nyre-skade i fiske ^6. Denne skaden i fiskeligner tapet av rørformede epitel og arrdannelse i glomeruli som oppstår hos mennesker etter gentamicin overdose ^14. Induserende skade i sebrafisk av gentamicin injeksjon er en praktisk måte å indusere en sterk, synkron regenerering respons, med mange nye nephrons produsert og samtidig fortsetter gjennom stadier av formasjonen, spredning og differensiering.

Denne protokollen detaljer vår metode for robust og reproduserbar skade i voksen sebrafisk nyre ved å benytte en ikke-invasiv visuell screening prosess for å minimere uteliggere. Vi tar nytte av det faktum at skader med gentamicin fører til døden av epithelial nyrevevet og formation av tubulære kaster, som deretter akkumuleres i massene i mesonefrosgangen kanaler og cloaca. Disse er passert av fisken og kan observeres visuelt i vannet. Dette gir oss muligheten til å screene for fisk med sterk-dødelige skader, som deretter kan samles for videre eksperimentering. Redusering av antall uskadd fisk eller fisk som dør før de når endepunktet av forsøket fører til mer enhetlig og effektiv datainnsamling og analyse. I tillegg er ingen spesielle enheter eller reagenser som kreves, noe som gjør denne metoden kostnadseffektiv og egnet for bruk i en akademisk eller undervisning innstilling. Ved å bruke vår metode, her vi vise den økende effekten av gentamicin dose på nyre regenerering, så vel som effekten av økt temperatur.

Protocol

MERK: Etikk Uttalelse: Alle forsøkene ble utført i samsvar med Massachusetts General Hospital retningslinjer for bruk av dyr i forskning. 1. Advance Utarbeidelse Bestem hvor mange voksne sebrafisk 6-12 måneder gammel til å skade. Plan for å skade 10-20% mer fisk enn vil være nødvendig. For å minimalisere variabiliteten bruk alder tilpasset søsken fisk alet sammen i samme tank, slik at de er omtrent samme størrelse og har mindre genetisk variabilitet. Hunnfisk er mye lett…

Representative Results

Gentamicin skade kan bekreftes visuelt ved observasjon av renal epitel avstøpninger i vannet (figur 1). Ulike doser av gentamicin ble brukt til å skade voksen villtype TuAB sebrafisk, noe som resulterer i stadig flere lhx1a + cellulære aggregater i regenererende nyre (Figur 1A – D). Hvite kaster kan lett sees i vannet en dag etter skade (Figur 1E – H). En lav dose av gentamicin resulterte i de fleste fisk som ikke har noen k…

Discussion

Sebrafisk er ideell for å studere regenerering av voksne organer herunder voksen mesonefrosgangen nyre ^6. Nyere studier har tatt nytte av molekylære markører og nye transgene reporter linjer for å bedre karakter trinnene som oppstår under nephron regenerering og hva cellene kan være ansvarlig ^7,12. Observasjon av urin avstøpninger har blitt brukt i over et århundre å diagnostisere nyresykdom hos mennesker ^16. Her bruker vi nærvær av avstøpninger som en enkel, ikke-invasiv og …

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
gentamicin sodium sulfate	Sigma	G1264	TOXIC, purity varies from batch to batch
plastic transfer pipets	Fisher	13-711-7M
1 ml Norm-Ject syringes	Electron Microscopy Sciences	72520	green plastic syringes, ordinary 1ml syringes are OK, but harder to read accurately
30G1/2 needles	Becton Dickinson	305106
ethyl 3-aminobenzoaate methanesulfonate salt (tricaine)	Sigma	A5040	IRRITANT
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Make 4% in 1xPBS for working solution