用于显微注射的方法<em> Patiria minata</em>合子
Summary
产生morphant胚胎的方法是必不可少的学习发展机制和基因调控网络。海星Patiria君子兰是这些研究的一个新兴的模型系统。在这里，我们提出了一个协议获得配子，胚胎生产的文化，并从该植物受精卵显微注射迅速。
Abstract
棘皮动物，长期以来就是繁殖和发展研究的最喜爱的模型系统，以及最近的基因调控和发育过程的演化的研究。海星，Patiria君子兰 ，是获得流行为这些类型的研究而以前进行几乎完全的海胆， 海胆紫石和Lytechinus斑的模型系统。这些模型系统的优点是易于制备改性胚胎中的特定基因或下调，标记细胞的一个群体，或引入报告基因。单一显微注射方法能够创建各种这样的修改胚胎的。在这里，我们提出了一个方法，从体育取得配子君子兰 ，产生受精卵，并经由显微注射引入扰动的试剂。健康morphant胚随后隔离GE的定量和定性研究NE功能。基因组和转录组数据，这个有机体的可用性增加了执行和便于执行它们的研究类型。
Introduction
海星，Patiria君子兰 ，（俗称蝙蝠星）正在成为一个有趣的和通用的模型系统，适用于各种细胞1-3，4,5发育，进化6-8和生态研究9-11。成人体育君子兰分布以及从锡特卡，阿拉斯加到巴哈加利福尼亚州12太平洋沿岸和海洋水族馆很容易维护。卵母细胞获得全年每一位女性能够摆脱鸡蛋数以万计。卵母细胞容易成熟，受精外部13。由此产生的胚胎是透明的，允许，便于观察;他们同步发展，并且只需要海水的发展。全基因组组装和多个转录，也可用于P。君子兰 （ Echinobase.org ）。这些优点使其非常适合各种研究与教学之用。
近年来，P.君子兰已成为发育的基因调控网络模型系统分析14-16。这些研究的目的是确定调节基因的整个称赞，并确定它们之间的相互作用的网络。这项工作的，需要通过引入反义寡核苷酸或体外合成的mRNA扰动的基因表达。此外， 顺式调控分析用于表征调节DNA 15的功能。这些分析需要引入扰动试剂和/或DNA报道构建成胚胎。此外，以表征这些扰动的下游作用，必须测定许多胚胎的变化的潜在靶基因的表达。对于数百受精卵的显微注射技术是核心对这项工作。
棘皮类动物，其中包括体育君子兰 </em>的，需要很多个月才能达到性成熟。因为这一点，所以一般不实用，开发和维护用于实验的转基因株系这些动物。因此，转基因的成年人育种不能有效地创建改性胚胎。相反，扰动必须发生从头通过显微注射。注射提供了一个机会来修改胚胎试剂不属于细胞渗透性。以下协议描述的方法引入DNA，基因，细胞示踪和吗啉反义寡核苷酸为数百个受精卵在一个2-3小时坐通过显微注射。这将产生足够的材料，适用于各种下游实验包括，但不限于，定量PCR， 原位杂交，RNA测序和Western印迹。
Protocol
Representative Results
Discussion
但是也有一些困难，这种技术的初学者，但对于成功创建morphant胚胎必不可少的两个关键步骤。首先是选择健康的卵母细胞，将成熟和受精正常。正常发展的一种文化的百分比取决于季节，动物的健康，以及卵母细胞已收获从单一个体的次数。卵母细胞往往是从四月到十月质量更好。仔细看看卵母细胞着手确保广大看起来像图2A，而不是图2B以前是很重要的。但也允许有少…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由美国国家科学基金会的IOS 0844948和1024811的IOS支持
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 1-Methyladenine | Acros Organics (Fisher Scientific) | AC20131-1000 | |
| 190 micron nitex nylon filter | Small Parts (originally Sefar) | CMN-0185-C/5PK-05 | |
| 100 micron nitex nylon filter | Small Parts (originally Sefar) | CMN-0105-C/5PK-05 | |
| Polystyrene Petri Dishes, 60mm x 15mm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Capillary tubing | FHC, Inc | 30-30-0 | For pulling microinjection needles |
| Model P-97 Needle Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Dextran, Rhodamine Green | Life Technologies | D7163 | If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer |
| Instant Ocean Sea Salt | Doctors Foster and Smith | CD-116528 | Also available in many pet stores |
| Microloader Tips | Eppendorf | 5242 956.003 |
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