La neurotossina botulinica è una delle tossine più potenti tra gli agenti di minaccia biologica di categoria A, ma non è disponibile una terapia post-esposizione. L'approccio di imaging ad alto contenuto è una potente metodologia per identificare nuovi inibitori in quanto consente lo screening multiparametrico utilizzando motoneuroni biologicamente rilevanti, il bersaglio principale di questa tossina.
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Articolo metodologico
Un alto dosaggio Imaging contenuti per l'identificazione di neurotossina botulinica inibitori
In questo articolo
Sommario
Abstract
La proteina-25 associata al sinaptosomio (SNAP-25) è un componente del complesso solubile del recettore della proteina di attaccamento NSF (SNARE) che è essenziale per il rilascio del neurotrasmettitore sinaptico. La neurotossina botulinica sierotipo A (BoNT/A) è una metalloproteasi di zinco che blocca l'esocitosi del neurotrasmettitore scindendo il componente SNAP-25 del complesso SNARE. Attualmente non ci sono farmaci autorizzati per il trattamento dell'avvelenamento da BoNT/A dopo l'internalizzazione della tossina da parte dei motoneuroni. Lo sviluppo di misure terapeutiche efficaci per contrastare l'intossicazione da BoNT/A è stato limitato, in parte a causa della mancanza di robusti saggi ad alto rendimento per lo screening di librerie di piccole molecole. Qui descriviamo un saggio di imaging ad alto contenuto (HCI) utile per l'identificazione di inibitori BoNT/A. Gli sforzi iniziali di ottimizzazione si sono concentrati sul miglioramento della riproducibilità dei risultati tra le placche in più esperimenti indipendenti. È stato riscontrato che l'automazione dell'immunocolorazione, l'acquisizione e l'analisi delle immagini aumentano la coerenza del saggio e minimizzano la variabilità, consentendo al contempo la valutazione multiparametrica di composti sperimentali in un sistema di motoneuroni murini.
Introduzione
Il batterio Clostridium botulinum produce neurotossina botulinica, una delle più potenti tossine biologiche conosciute all'uomo 1. Ci sono 7 diversi sierotipi BoNT (BoNT / AG). BoNT / A-Gall indurre paralisi a livello della giunzione neuromuscolare a causa di complessi SNARE proteolisi 2,3. SNARE proteolisi impedisce neurotrasmettitore vescicole-fusione delle membrane e quindi blocchi neurotrasmettitore 4. Il target SNARE specifica dipende dal particolare sierotipo BoNT coinvolti nel processo intossicazione. BoNT / A e BoNT / E fendere SNAP-25, mentre BoNT / C scinde sia SNAP-25 e sintaxina 5. I restanti sierot....
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Protocollo
Piatto 20.000 differenziate cellule staminali embrionali di topo (MES) / pozzetto in piastre da 96 lisina rivestito Poly-D e così mantenere in motoneurone differenziazione terminale dei media per 5-7 giorni.
1. Compound Amministrazione e Intossicazione con BoNT / A
Eseguire tutti i seguenti lavori in un recinto BSL2 per mantenere la conformità con le linee guida CDC / NIH.
- Preparare 10 mM soluzioni madre di ciascun composto libreria in 100% DMSO in polipropilene piastre da 96 pozzetti. Utilizzare lo stock 10 mM per preparare un piatto di diluizione intermedia che è 10 volte superiore alla concentraz....
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Risultati
I dati di controllo alta e bassa create due distinte popolazioni con la differenza delle due mediane superiori a 3 deviazioni standard (Figura 7A). L'obiettivo del processo di screening è quello di trovare i composti all'interno della popolazione campione con valori più vicini alla popolazione di controllo positivo, ipotizzando una distribuzione normale nella popolazione campione (Figura 7B, (i)). Punti di dati che sono 3 deviazioni standard oltre la media sono considerati statisticamen.......
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Discussione
L'elevata potenza di neurotossine botuliniche e la relativa facilità del loro militarizzazione ha portato nella loro classificazione come categoria A (priorità più alta) agenti biothreat dai Centri statunitensi per il controllo e la prevenzione delle malattie. Purtroppo, non ci sono FDA ha approvato terapie per contrastare BoNT intossicazione dopo la tossina è stato interiorizzato dai motoneuroni. Qualsiasi meccanismo di druggable che promuove il recupero neuronale da BoNT intossicazione potrebbe portare allo svilup.......
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Dichiarazioni
Krishna P Kota è un dipendente della Perkin Elmer Inc. Waltham, MA, che produce gli strumenti e il software utilizzati in questo manoscritto. Il contenuto di questa pubblicazione non riflette necessariamente le opinioni o le politiche del Dipartimento della Salute e dei Servizi Umani degli Stati Uniti, del Dipartimento della Difesa degli Stati Uniti, del Dipartimento dell'Esercito degli Stati Uniti o delle istituzioni e delle società affiliate agli autori.
Ringraziamenti
Il finanziamento è stato fornito dal Joint Science and Technology Office – Chemical Biological Defense (JSTO-CBD) Defense Threat Reduction Agency (DTRA) con il numero di progetto sponsor CCAR# CB3675 e dal National Institutes of Health (1 R21 AI101387-01 e 5 U01AI082051-05).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Neurotossina botulinica A | Metabiologics | NA | Nessun numero di catalogo |
| Piastre per microtitolazione | Greiner | 655946 | Piastre a 96 pozzetti in poli-D-lisina |
| BAC anticorpo | Lampire Biological | NA | |
| Microchem | National | 0255 | |
| Metanolo | Thermo Scientific | A412-20 | |
| Formaldeide | Thermo Scientific | 28908 | |
| Siero di cavallo | Invitrogen | 16050 | |
| PE JANUS MDT Mini stazione di lavoro automatizzata | Perkin Elmer | AJMDT01 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| BIII anticorpo della tubulina | R& D Systems | BAM1195 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379-1L | |
| Hoechst 33342dye | Invitrogen | 3570 | |
| Antimouse IgG | Invitrogen | A21236 | |
| Anti coniglio IgG | Invitrogen | A10042 | |
| Columbus Software di analisi delle immagini | Perkin Elmer | Ver 2.4 | |
| Spotfire | Perkin Elmer | Ver 5.5 | |
| Clorox bleach | Fisher Scientific | 18-861-284 | |
| PlateStack |
Riferimenti
- Lamanna, C. The most poisonous poison. Science. 130, 763-772 (1959).
- Dover, N., Barash, J. R., Hill, K. K., Xie, G., Arnon, S. S. Molecular Characterization of a Novel Botulinum Neurotoxin Type H Gene. J. Infect. Dis. , (2013).
- Hakami, R. M., Ruthel, G., Stahl, A. M., Bavari, S.
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Ristampe e permessi
