Infusions de l'artère carotide pour pharmacocinétiques et pharmacodynamiques Analyse des taxanes chez la souris

Summary

Cette méthode a été développée dans le but de fournir une solution stable de médicament via l'artère carotide, pour évaluer la pharmacocinétique de nouveaux médicaments dans des modèles murins.

Abstract

Au moment de proposer l'utilisation d'un médicament, la combinaison de médicaments, ou l'administration de médicaments dans un nouveau système, il faut évaluer la pharmacocinétique du médicament dans le modèle d'étude. Parce que l'utilisation de modèles de souris sont souvent une étape essentielle dans la découverte de médicaments préclinique et le développement de médicaments ^1-8, il est nécessaire de concevoir un système pour introduire des médicaments dans des souris dans une manière uniforme, reproductible. Idéalement, le système devrait permettre la collecte des échantillons de sang à intervalles réguliers au cours d'une évolution dans le temps de consigne. La capacité de mesurer les concentrations de médicament par spectrométrie de masse, a permis aux enquêteurs de suivre les changements dans les niveaux plasmatiques du médicament au fil du temps chez les souris individu ^{1, 9, 10.} Dans cette étude, le paclitaxel a été introduit dans des souris transgéniques comme une perfusion artérielle continue sur trois heures, tandis que les échantillons de sang ont été prélevés en même temps par des saignements rétro-orbital à des instants de consigne. Infusions de l'artère carotide sont une alternative potentielle aux perfusions de veine jugulaire, lorsque des facteurs tels quetumeurs mammaires et d'autres obstacles infusions jugulaires impraticable. En utilisant cette technique, les concentrations de paclitaxel dans le plasma et les tissus ont atteint des niveaux similaires à celles obtenues à perfusion jugulaire. Dans ce tutoriel, nous allons démontrer comment son cathéter avec succès l'artère carotide par la préparation d'un cathéter optimisé pour chaque modèle de la souris, puis montrer comment insérer et fixer le cathéter dans l'artère carotide de souris, passer la fin du cathéter à travers l'arrière du cou de la souris, et brancher la souris à une pompe pour fournir une vitesse contrôlée de médicament afflux. Saignements rétro-orbital à faible volume multiples permettent l'analyse des concentrations plasmatiques du médicament au fil du temps.

Introduction

perfusion de médicament à travers la carotide peut être effectuée de manière fiable et reproductible en optimisant l'équipement et la technique. La procédure est complexe pas, même si elle ne nécessite un contrôle précis et une attention aux détails. Soins de qualité supérieure et la dextérité sont nécessaires pour isoler l'artère carotide et insérer le cathéter, qui peuvent généralement être acquis par la pratique. Chirurgie par un technicien expérimenté ne doit pas dépasser une heure. Après une chirurgie réussie, la souris doit être normal et en bonne santé (bien que la souris peut réagir à la perfusion réelle de la drogue), et la drogue (s) peut être administré dans un dosage continu uniforme contrôlée. Les échantillons de sang doivent être prélevés sur un site autre que l'artère carotide; saignements rétro-orbitaire été facile de recueillir et satisfaisante pour l'analyse des concentrations de médicament.

Cathéters de taille optimale et la forme sont un atout précieux dans la réalisation d'une perfusion de succès ^11. Nous avons trouvé la cathéters disponible commercially souvent d'être trop grande et / ou trop souple pour permettre un accès facile à l'artère carotide de souris. Il est avéré préférable de cathéters de mode du tube de polyéthylène utilisé pour connecter la souris à la seringue de perfusion. Ainsi, tous les tubes, raccords et les aiguilles étaient de dimensions cohérentes, qui a simplifié ensemble d'infusion. En utilisant cette technique, il est nécessaire de pousser la pointe du cathéter dans l'artère au-delà du point où il est encore visible, et le flux sanguin dans l'artère carotide est pas restauré avant que le cathéter est initialement fixé. Cela réduit les risques de perforation de l'artère ou d'avoir le cathéter poussé par la haute pression du flux sanguin. La conception de cathéter document ne comporte pas de "bosse" pour le maintenir en place, en assurant ainsi le cathéter bien avec des sutures et ruban chirurgical est une priorité.

Infusions peuvent être préférables aux injections en bolus iv communs, comme un meilleur imitateur de l'administration clinique deles médicaments tels que les taxanes ^{3, 12, 13.} La technique décrite ici a été initialement mis au point pour permettre une perfusion dans des modèles de souris, dans lequel l'accès à la veine jugulaire ou fémorale a été empêchée par la croissance de la tumeur mammaire et / ou la vascularisation excessive de la zone d'insertion. Cette méthode peut souvent être appropriée, même chez les souris sans tumeur: bien isoler et cathétérisme de la carotide est légèrement plus invasive, nous avons trouvé qu'il est préférable de la jugulaire, car la propension de la paroi jugulaire de ripper abouti à des insertions et des échecs pour mener à bien plus défaillants l'évolution dans le temps de trois heures.

Bien que les résultats présentés ici sont de C57BL / 6J (dans maison de race-) souris, nous avons utilisé cette technique pour insuffler avec succès paclitaxel dans plusieurs souches de souris, y compris FVB et mixtes souches, de suivre la pharmacocinétique chez des modèles de souris transgénique manipulés à réguler à la baisse fonctions transporteurs cellulaires. Les échantillons de sang et de tissus prélevés ont montré des niveaux attendus de paclitaxel, dans la gamme des niveaux observés après une perfusion jugulaire ^1. Cette technique peut être appelé à travailler aussi bien dans d'autres modèles de souris et avec d'autres solutions pour perfusion.

Protocol

Ce protocole a été approuvé par le Comité institutionnel de protection Cancer Center et l'utilisation des animaux Fox Chase et par le Fonds des animaux de laboratoire, et jugée conformément aux directives institutionnelles pour le traitement sans cruauté des animaux. 1. Préparation préliminaire Préparation de la sonde: Préparer un cathéter à partir d'une courte longueur de tube en polyéthylène, modifié pour former un amincie, extrémité émoussée …

Representative Results

Répartition de paclitaxel suit modèles prévisibles pendant 3 heures un schéma posologique d'une injection à grande vitesse 15 min, suivie d'une perfusion à faible vitesse de 165 min. La figure 1 montre une comparaison de la veine-perfusion de paclitaxel concentrations de plasma jugulaire et l'artère carotide-infusions. Les concentrations de paclitaxel tombent rapidement dans les 15 premières minutes après une perfusion de grand volume initial, puis…

Discussion

Perfusion de l'artère carotide est une technique importante dans cette étude de pharmacocinétique du paclitaxel. Perfusion de l'artère carotide est une méthode pour distribuer rapidement drogue dans tout le système circulatoire ^14. La perfusion de 3 heures est un synoptique plus proche de l'administration clinique des médicaments tels que les taxanes que les injections de bolus. La chirurgie peut être réalisée de manière fiable par une seule personne, le temps de chirurgie est relativem…

Materials

Table of specific reagents and equipment:	Source:	Catalog Number	Comments
Polyethylene tubing 0.024”OD X 0.011”ID	Braintree Scientific, Inc.	PE10
Stainless steel port plug (30 gauge)	Braintree Scientific, Inc.	NB-30
2 Stainless steel connector plugs (28 gauge)	Braintree Scientific, Inc.	PP-28	Slightly larger than PE tubing ID, to fit snugly and keep a tight seal.
3 Blunted needles (30 gauge)	Braintree Scientific, Inc.	C-30
3 1cc syringes	Becton, Dickinson and Co.	309659
Sterile 0.9% Saline solution	Hospira	0409-7984-37
Cath-Loc HGS Heparin/Glycerol Solution	Braintree Scientific, Inc.	HGS
Silk suture	Braintree Scientific, Inc.	SUT-S 113
Vanna Scissors (micro-scissors)	World Precision Instruments	14122	This model has a curved tip, but straight-tip scissors work as well.
Hartman Mesquito Hemostatic Forceps	World Precision Instruments	501705
Betadine Swabsticks	Perdue Products L.P.	BSWS1S
Bupivacaine	Hospira	0409-1160-01	May be replaced with Lidocaine, or similar local anesthesia.
Paclitaxel	LC Laboratories	P-9600
Methanol	Sigma-Aldrich	32213
Micro-Hematocrit Capillary Tubes, Heparinized	Fisher Scientific	22-362-566
Capillary Tube Sealant	Fisher Scientific	02-678
C57BL/6J mice	Fox Chase Cancer Center, Laboratory Animal Facility in-house-bred
API 4000 Q-Trap mass spetrometer	Applied Biosystems