Primære cellekultur ved hjelp av intakte vev organoids gir et modellsystem som etterligner multi-mobilnettet in vivo mikromiljøet. Vi utviklet et serum-free primære brystepitel vevskultur modell som foreviger blandede cellekultur linjene og utstillinger differensierte morfologi, uten enzymatisk vev avbrudd. Bryst organoids være levedyktig i> 6 måneder.
Bryst duktalt carcinoma in situ (DCIS), per definisjon, er spredning av neoplastiske epitelceller innenfor rammen av bryst duct, uten å bryte collagenous basalmembran. Mens DCIS er en non-obligat forløper til invasiv brystkreft, er de molekylære mekanismer og cellepopulasjoner som tillater progresjon til invasiv kreft ikke fullt ut kjent. For å bestemme om progenitor-celler i stand til invasjons eksisterte i DCIS cellepopulasjon, har vi utviklet en metode for innsamling og dyrking sterilt humant brystvev ved tidspunktet for kirurgi, enzymatisk uten avbrudd av vev.
Sterile brystvev som inneholder duktale segmenter er høstet fra kirurgisk excised brystvev følgende rutine patologisk undersøkelse. Vev som inneholder DCIS er plassert i næringsrikt, antibiotika-inneholdende, serumfritt medium, og transportert til laboratoriet vevskultur. Brystvevet er videre dissekertd for å isolere de forkalkede områder. Multiple brystvev stykker (organoids) er plassert i et minimalt volum av serumfritt medium i en kolbe med et avtagbart lokk, og dyrket i en fuktet CO2-inkubator. Epiteliale og fibroblast cellepopulasjoner dukke opp fra organoid etter 10 – 14 dager. Mammospheres spontant danne på og rundt epitelcelle monolayer. Spesifikke cellepopulasjoner kan høstes direkte fra flasken uten å forstyrre nabocellene. Våre ikke-enzymatisk vev kultur system avslører pålitelig cytogenetisk unormale, invasive stamceller fra friske menneskelige DCIS lesjoner.
Spredning av epitelceller innenfor rammen av bryst kanaler og alveolene (ductal carcinoma in situ) er anerkjent som en obligat forløper til invasiv ductal og lobular brystkreft. Ikke desto mindre er de molekylære mekanismer og dynamikk cellepopulasjon som tillater progresjon til invasiv kreft dårlig forstått. Belyse overlevelsesmekanismer som brukes av pre-invasive brystkreft celler, eller en hvilken som helst pre-invasive svulster, kan avsløre terapeutiske strategier for å drepe, eller hindre, pre-invasive svulster 1. Imidlertid har enkle lavkost metoder for funksjonelt studerer menneskelige pre-invasive lesjoner vært mangelfull. Selv om in vitro-monolag-kultur av transformerte cellelinjer er en etablert fremgangsmåte laboratorie, genotype og fenotype av disse udødeliggjorte cellelinjer unnlater å rekapitulere molekyl status av primære humane tumorceller 2. Videre, til og med den ikke-tumorigen MCF-10A-cellelinjen, som Recapitulates 3-D melkekjertlene arkitektur, unnlater å representere funksjonell fenotype og molekylære egenskapene til den enkelte pasients pre-invasiv bryst lesjon 3,4 tilstrekkelig.
For å bestemme om stammeliknende neoplastiske celler i stand til invasjons eksistert innen duktalt karsinom in situ (DCIS) cellepopulasjon, har vi utviklet en metode for innsamling og dyrking sterilt humant brystvev ved tidspunktet for kirurgi (figur 1) 5. Vår ex vivo bryst organoid kultursystemet ikke er avhengig av enzymatisk vev avbrudd, basalmembranekstrakt matrise eller fibroblast uttømming, for å isolere og som forplanter seg mammosphere-dannende celler fra friske humane bryst duktalt karsinom vev 6-8. Vår nye systemet er basert på prinsippet om celle streaming / migrasjon 5. De bare bryst kanaler, og omkringliggende stroma blir neddykket i et minimalt volum av serumfritt næringsmedium (e barenough å dekke kanal fragmenter) for å maksimere gassutveksling, med snittflaten av kanalen eksponert til kulturmediet, men på ingen bestemt retning i kolben (figur 1E-F). Denne kulturen systemet tillater celler til å migrere ut av kanalen og inn / ut mot autologe stroma og kulturflaske. Den næringsmedium, supplert bare med epidermal vekstfaktor (EGF), insulin, og antibiotika, støtter veksten av blandede cellepopulasjoner som kommer fra organoid. Den vevskulturkolbe har et avtagbart, lukkbar lokk som gjør det mulig for organoids og / eller celler som skal høstes uten å forstyrre hele kolbe eller nabo organoids, og samtidig opprettholde et sterilt miljø fuktet.
Kulturen systemet beskrevet her utgjør en ny modell for å generere levende pre-invasive neoplastiske bryst celler for grunnleggende og translasjonsforskning studier. I det siste har pre-ondartet brystkreft progresjon vanligvis blitt studert ved hjelp av tre forskjellige metoder. Den første metoden er histopatologisk og genetisk analyse av frosne microdissected eller faste humane prøvene 12-14. Den andre metoden benytter musemodeller som inneholder hyperplastiske alveolære knuter (HAN lesjoner) som er ten…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble delvis støttet av (1) Department of Defense Breast Cancer Research Program (US Army Medical Research Acquisition Activity) award # W81XVVH-10-1-0781 til LAL og VE, og (2) Susan G. Komen Foundation stipend IR122224446 i Lal og VE. Patologi støtte og vev innbringende ble vennlig levert av Inova Fairfax Pathology avdeling, Dr. Hassan Nayer, Dr. Geetha A. Menezes, og Dr. Charles Bechert. Pasientsamtykke og prøve anskaffelser ble fagmessig guidet av Inova Fairfax Hospital klinisk forskningskoordinatorer Holly Gallimore, Heather Huryk, og Emil Kamar.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Ethanol | Fisher | A405-P | prepare a 70% solution in Type 1 reagent grade water |
18 MΩ-cm water, sterile filtered | sterile filtered, Type 1 reagent grade water | ||
10cc plastic disposable syringe, sterile | BD | 305482 | |
0.2µm polyethersulfone (PES) syringe filter, sterile | Thermo Scientific | 194-2520 | |
15ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 14-959-49B | |
50ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 05-539-6 | |
1.5ml low retention microcentrifuge tubes,sterile | Fisher | 02-681-331 | |
nutrient medium, DMEM-F12/HEPES | Invitrogen | 11330-032 | with L-glutamine |
Insulin, human recombinant | Roche | 11376497001 | 10mg/ml stock |
Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant | Millipore | GF144 | 100µg/ml stock |
Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S1567 | 10mg/ml stock |
Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G19114 | 10mg/ml stock |
Filtration flask and filter top, sterile | Millipore | SCGPU02RE | 0.22µm PES membrane |
25ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4489 | paper-plastic wrapped |
10ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4488 | paper-plastic wrapped |
Tissue marking dyes (black, blue, red, green, yellow and orange) | CDI | MD2000 | after opening use only with single-use, sterile cotton tipped applicators, or use once and discard |
Cotton tipped applicators, sterile | Fisher | 23-400-115 | single use only |
Gauze pads, 10x10cm, sterile | Fisher | 2187 | |
Plastic transfer pipettes, sterile, disposable | Samco | 202-20S | |
Vinegar, white distilled | household use | 5% acetic acid; after opening use only with sterile pipettes | |
#10 scalpels, sterile, disposable | Thermo Scientific | 31-200-32 | |
petri dish, sterile | Fisher | FB0875713A | |
TPP 115cm2 flask, with removable lid | MidSci | 90652 | screw cap with filter |
CO2 incubator | Fisher | 13-998-074 | 5% CO2, 37 oC, humidified chamber |
inverted light microscope | Olypmus | IX51 | |
8M urea | Fisher | BP169-500 | optional, for mass spectrophotometric analysis of cultured cells |
2X SDS tris-glycine buffer | Life Technologies | LC2676 | optional, for proteomic analysis of cultured cells |
Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | optional, for preparing cell smears |