Sağlam doku organoids kullanılarak primer hücre kültürü çok hücresel in vivo mikroortam taklit eden bir model sistemi sağlar. Biz enzimatik doku hasarı olmadan, morfoloji farklılaşmış karışık hücre kültürü soyları ve sergiler yaşatan bir serum serbest birincil meme epitel doku kültürü modeli geliştirmiştir. Meme organoids> 6 ay için geçerli kalır.
In situ (DCIS) Meme duktal karsinom, tanımı gereği, kollajenöz bazal membran ihlal etmeden, meme kanalının sınırları içinde neoplastik epitel hücrelerinin proliferasyonudur. DCIS invaziv meme kanserleri olmayan bir zorunlu habercisi iken, invaziv kansere ilerlemesinin izin moleküler mekanizmalar ve hücre popülasyonları tam olarak bilinmemektedir. Işgalinin yeteneğine progenitör hücrelerin DCIS hücre popülasyonu içinde mevcut olup olmadığını belirlemek için, doku enzimatik bozulma olmadan, ameliyat sırasında steril insan meme dokusu toplanması ve kültürü için bir yöntem geliştirdi.
Duktal segmentleri içeren steril meme dokusu rutin patolojik incelemede aşağıdaki cerrahi olarak çıkarıldı meme dokusu hasat edilir. DCIS ihtiva eden doku, doku kültürü laboratuara besin yönünden zengin, antibiyotik içeren, serumsuz ortama yerleştirilebilir, ve nakledilir. Meme dokusu daha dissecte olduğunud kalsifiye alanları izole etmek. Birden fazla meme dokusu parçaları (organoids) nemlendirilmiş bir CO2 kuluçka makinesi içinde çıkarılabilir bir kapak ve kültürlenmiş olan bir şişe içinde, serum barındırmayan ortam içinde en az bir hacim içinde yerleştirilir. 14 gün – epitel ve fibroblast hücre popülasyonları 10 sonra organoid ortaya. Kendiliğinden oluşan ve epitel hücre tek tabaka etrafında Mammospheres. Özgül hücre popülasyonları arasında, komşu hücreleri bozmadan şişeden doğrudan hasat edilebilir. Bizim enzimatik olmayan doku kültürü sistemi, güvenilir taze insan DCIS lezyonlarında gelen sitogenetik anormal, invaziv ata hücreleri ortaya koymaktadır.
Meme kanalları ve alveollere (in situ duktal karsinom) sınırları içinde epitel hücrelerinin çoğalması invaziv duktal ve lobüler meme kanserine bağlı zorunlu bir habercisi olarak kabul edilmektedir. Bununla birlikte, invaziv kansere ilerlemesinin izin moleküler mekanizmalar ve hücre popülasyon dinamiği tam olarak anlaşılamamıştır. Önceden istilacı meme karsinomu hücreleri veya herhangi bir ön-invaziv tümör tarafından kullanılan hayatta kalma mekanizmalarını, açıklık getirecek öldürme, ya da, ön-invazif neoplazmaların 1 önlenmesi için tedavi stratejileri ortaya çıkarabilir. Ancak, işlevsel okuyan insan pre-invaziv lezyonlar için düşük maliyetli basit yöntemler eksik edilmiştir. Dönüştürülmüş hücre çizgileri in vitro tek tabakalı kültürü oluşturulmuş bir laboratuar yöntemi olup, bu ölümsüz kılınmış hücre kuşaklarının fenotip ve genotip olsa da, birincil insan tümör hücreleri 2 moleküler durumunu özetlemek için başarısız olur. Bunun da ötesinde, Tümörjenik MCF-10A hücre hattı, burada recapitulates 3-D meme bezi mimarisi, yeterince fonksiyonel fenotip ve bireysel bir hastanın pre-invaziv meme lezyonu 3,4 moleküler özelliklerini yansıtmamaktadır.
Işgalinin yeteneğine kök benzeri neoplastik hücrelerin in situ (DCIS) hücre popülasyonunda duktal karsinom içinde mevcut olup olmadığını belirlemek için, (Şekil 1) 5 toplanması ve cerrahi sırasında steril insan meme dokusu kültürü için bir yöntem geliştirdi. Bizim ex vivo meme organoid kültür sistemi izole ve taze insan meme duktal karsinoma dokusunun 6-8 mammosphere oluşturan hücrelerin çoğaltılmasına yönelik, enzimatik doku bozulması, bazal membran ekstresi matris veya fibroblast tükenmesine dayanmaz. Yeni sistem, hücre akış / göç 5 esasına dayanır. Fark meme kanalı, ve çevresindeki stromal serumsuz Besleyici ortam (sadece e ait minimum bir hacmi içinde batıkKültür ortamının etkisine maruz kalan kanal kesme yüzeyi ile, gaz alış-verişini en üst düzeye çıkarmak, ama şişenin (Şekil 1E-F) belli bir yön olarak) kanal parçalarını kapsayacak şekilde nough. Bu kültür sistemi hücreleri otolog stroma ve kültür şişesi üzerine kanalın dışına ve / 'a taşımasına olanak tanır. Sadece Epidermal Büyüme Faktörü (EGF), insülin ve antibiyotikler ile takviye edilmiş bir besin ortamı, organoid çıkan karma hücre popülasyonlarının büyümesini desteklemektedir. Doku kültürü şişesi Steril nemlendirilmiş bir ortamı muhafaza ederken, organoids ve / veya hücreler tüm şişe veya komşu organoids bozmadan hasat edilmesine olanak tanıyan çıkartılabilir, tekrar kapatılabilen bir kapak yer alır.
Burada tarif kültür sistemi temel ve translasyonel araştırma çalışmaları için yaşayan pre-invaziv neoplastik meme hücreleri üretmek için yeni bir model oluşturmaktadır. Geçmişte, pre-malignan göğüs kanserindeki ilerlemeler, tipik olarak üç farklı yöntem kullanılarak incelenmiştir. İlk yöntem histopatolojik ve microdissected dondurulmuş veya sabit insan örneklerinin 12-14 genetik analizi. İkinci yöntem, insan pre-invaziv meme lezyonlarının 15 benzer olduğu düşün…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma ile kısmen desteklenmiştir (1) Savunma Bakanlığı Meme Kanseri Araştırma Programı (US Army Medical Research Toplama Aktivitesi) # LAL için W81XVVH-10-1-0781 ve VE ödül ve (2) Susan G. Komen Vakfı hibe IR122224446 Lal ve VE etmek. Patoloji destek ve doku grossing nazik Inova Fairfax Patoloji Anabilim Dr. Hasan Nayer, Dr. Geetha A. Menezes, Dr. Charles Bechert'in tarafından sağlandı. Hasta rızası ve örnek ihale ustalıkla Inova Fairfax Hastanesi'nde klinik araştırma koordinatörleri Holly Gallimore Heather Huryk ve Emil Kamar tarafından yönlendiriliyordu.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Ethanol | Fisher | A405-P | prepare a 70% solution in Type 1 reagent grade water |
18 MΩ-cm water, sterile filtered | sterile filtered, Type 1 reagent grade water | ||
10cc plastic disposable syringe, sterile | BD | 305482 | |
0.2µm polyethersulfone (PES) syringe filter, sterile | Thermo Scientific | 194-2520 | |
15ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 14-959-49B | |
50ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 05-539-6 | |
1.5ml low retention microcentrifuge tubes,sterile | Fisher | 02-681-331 | |
nutrient medium, DMEM-F12/HEPES | Invitrogen | 11330-032 | with L-glutamine |
Insulin, human recombinant | Roche | 11376497001 | 10mg/ml stock |
Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant | Millipore | GF144 | 100µg/ml stock |
Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S1567 | 10mg/ml stock |
Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G19114 | 10mg/ml stock |
Filtration flask and filter top, sterile | Millipore | SCGPU02RE | 0.22µm PES membrane |
25ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4489 | paper-plastic wrapped |
10ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4488 | paper-plastic wrapped |
Tissue marking dyes (black, blue, red, green, yellow and orange) | CDI | MD2000 | after opening use only with single-use, sterile cotton tipped applicators, or use once and discard |
Cotton tipped applicators, sterile | Fisher | 23-400-115 | single use only |
Gauze pads, 10x10cm, sterile | Fisher | 2187 | |
Plastic transfer pipettes, sterile, disposable | Samco | 202-20S | |
Vinegar, white distilled | household use | 5% acetic acid; after opening use only with sterile pipettes | |
#10 scalpels, sterile, disposable | Thermo Scientific | 31-200-32 | |
petri dish, sterile | Fisher | FB0875713A | |
TPP 115cm2 flask, with removable lid | MidSci | 90652 | screw cap with filter |
CO2 incubator | Fisher | 13-998-074 | 5% CO2, 37 oC, humidified chamber |
inverted light microscope | Olypmus | IX51 | |
8M urea | Fisher | BP169-500 | optional, for mass spectrophotometric analysis of cultured cells |
2X SDS tris-glycine buffer | Life Technologies | LC2676 | optional, for proteomic analysis of cultured cells |
Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | optional, for preparing cell smears |