La rimozione degli occhi, chiamato anche enucleazione, fornisce una strategia utile per studiare gli aspetti di visual, cross-modale, e la plasticità dello sviluppo lungo il sistema visivo dei mammiferi poiché induce irreversibile parziale (monoculare) o completa (binoculare) perdita della vista. Qui si descrive un approccio altamente riproducibile e semplice da eseguire in vivo enucleazione.
Enucleazione o la rimozione chirurgica di un occhio possono generalmente essere considerate un modello per nervo deafferentazione. Esso fornisce un valido strumento per studiare i diversi aspetti della visuale, cross-modale e la plasticità dello sviluppo lungo il sistema visivo dei mammiferi 1-4.
Qui, dimostriamo una tecnica elegante e diretto per la rimozione di uno o entrambi gli occhi nel topo, che viene convalidato in topi di 20 giorni di età fino agli adulti. In breve, un disinfettati pinze curve viene utilizzato per bloccare il nervo ottico dietro l'occhio. Successivamente, movimenti circolari vengono eseguiti per costringere il nervo ottico e rimuovere il bulbo oculare. I vantaggi di questa tecnica sono alta riproducibilità, minimo a nessun sanguinamento, rapido recupero post-operatorio e una soglia molto bassa di apprendimento per lo sperimentatore. Quindi, una grande quantità di animali può essere manipolato e trattati con sforzo minimo. La natura della tecnica può indurre lievi danni alleretina durante la procedura. Questo effetto collaterale rende questo metodo meno adatti rispetto a Mahajan et al. (2011) 5, se l'obiettivo è quello di raccogliere e analizzare tessuto retinico. Inoltre, il nostro metodo è limitata ad aprire post-eye età (mouse: P10 – 13 in poi) in quanto il bulbo oculare deve essere spostato dalla presa senza rimuovere le palpebre. La tecnica di enucleazione in vivo descritto in questo manoscritto è stato recentemente applicato con successo con piccole modifiche nei ratti e sembra utile studiare il percorso visivo afferente dei roditori in generale.
Rimozione di un occhio e quindi irreversibilmente distruggendo la superficie del recettore sensoriale (retina), impone una notevole perdita di input sensoriali lungo il percorso visivo. Il modello enucleazione nel sistema visivo giovanile e adulta ha dimostrato di essere utile nella comprensione dello sviluppo, plasticità e la funzione dei diversi centri visivi 1-4. Le conseguenze molecolari, cellulari e fisiologici di questa deprivazione sensoriale in grado di fornire intuizioni su come normale sviluppo è regolato e come definiti, circuiti corticali affrontare e cambiano la loro struttura e funzione in risposta a una tale vasta alterazione esperienza.
Esistono diversi metodi di deprivazione visiva e tutti hanno i loro vantaggi specifici di ricerca sulla visione-correlati. Per esempio allevamento scuro specificamente elimina l'attività guidata visivamente ma non influenza l'attività retinica spontanea. Visua Allo stesso modo, suture coperchio o patch occhi Togliere modellatol ingresso senza disturbare l'attività spontanea, ma permettono la penetrazione della luce dispersa attraverso gli occhi chiusi. Tali metodi sono reversibili e hanno dimostrato di essere utile nella comprensione del ruolo della fantasia visione e di basso livello di correlazione degli ingressi binoculari a scolpire circuiti corticali durante lo sviluppo 6-8. Nella ricerca glaucoma, il nervo ottico modello cotta in animali adulti è stato ampiamente utilizzato perché stabilisce una progressiva perdita di ingressi cellule gangliari della retina che costituiscono il nervo ottico 9,10. D'altra parte, enucleazione, dove l'occhio e quindi la retina è completamente ed immediatamente rimosso, è la scelta appropriata di privazione quando lo scopo è quello di eliminare irreversibilmente visione sia spontanea e modellata in una volta. Induce anche una robusta attività di squilibrio intraoculare che può migliorare il rapporto segnale-rumore negli studi di mappatura dell'attività 11,12. Confrontando cambiamenti funzionali e strutturali in risposta a enucleazione con those dopo deprivazione con metodi meno drastici come il coperchio di sutura per esempio, potrebbe anche esporre nuove intuizioni sul ruolo dell'attività spontanea retinica in entrambi i tipi omeostatici e di plasticità sinaptica.
Enucleazione innesca una perdita di influenze trofiche negli obiettivi diretti della retina. Ad esempio, i livelli di BDNF sono significativamente inibiti nel nucleo genicolato laterale (LGN) e collicolo superiore di ratti adulti enucleati 13. Le specie reattive dell'ossigeno, che funzionano come molecole messaggere di mediare rimodellamento strutturale, sono state rilevate anche in strutture sottocorticali del ratto adulto sistema visivo 14. Inoltre, microglia e l'attivazione astrogliale attraverso diverse strutture di destinazione visive sottocorticali nel topo si verificano in un determinato lasso di tempo post-enucleazione di una settimana 15. Insieme, i risultati deafferentazione ottica in diverse risposte sottocorticali a gliale, piano strutturale e molecolare. Nonostante questi sottocorticaleeffetti, che non necessariamente implicano effetti a livello corticale 16. Degno di nota, plasticità corticale cross-modale, comprese le modifiche in altre aree sensoriali accanto al rafforzamento degli ingressi non visive alla corteccia visiva privato si verificano dopo sia monoculare (ME) 3,4,17,18 e binoculare (BE) 1,17 enucleazione.
Oltre a contribuire alla neuroscienza visiva, enucleazione come un tipo di deafferentazione può essere usato per studiare l'equilibrio tra neuroprotettivi 19 e neurodegenerative 20-22 proprietà del sistema nervoso centrale.
Diverse procedure per eseguire l'enucleazione sono già descritti in letteratura. Alcune metodologie per in vivo ME su ratti e topi sono meno semplici a causa di inutili sezionamento dei muscoli e dei tessuti orbitali 23-25. Altre pubblicazioni come Mahajan et al. (2011) 5 forniscono un protocollo dettagliato con scollamento per una collezione high-throughput di occhi per studiare le correlazioni genotipo-fenotipo, probabilmente post-mortem. Per il loro scopo, il metodo è comodo e veloce. Tuttavia, questo metodo è meno adatto in vivo enucleazione quando si opta per studiare il percorso visivo afferente seguente enucleazione (animali vivi), piuttosto che l'occhio stesso. In un tale ambiente, la sopravvivenza post-enucleazione è di grande importanza. Inoltre, minimal danni vivo e la conservazione del nervo ottico e del tessuto orbitale è favorevole. Qui, presentiamo un metodo alternativo enucleazione, più simile a quello descritto da Faguet et al (2008) 26, che offre alcune caratteristiche positive. Esso è associato ad un rapido recupero post-operatorio ed è caratterizzata da una soglia di apprendimento molto bassa per i ricercatori. In generale, diversi metodi sono complementari a seconda del focus della ricerca successiva: morfologia dell'occhio o di ricerca via visiva.
ve_content "> In sintesi, l'enucleazione può essere applicato dalla ricerca di visione verso ricerche di plasticità omeostatica e cross-modale cervello, proprietà di risposta gliali, e la stabilità assone. In questo articolo visualizzato, dimostriamo un metodo fattibile e affidabile per in vivo degli occhi enucleazione in il mouse.Per eseguire una enucleazione di successo secondo il nostro metodo, i passaggi più critici da considerare sono: 1) utilizzando una pinza con punta ricurva e seghettata di dimensioni adeguate; 2) eseguire l'enucleazione su una superficie liscia e asciutta; e 3) gradualmente accelerare i movimenti circolari in senso con il minimo attrito.
Per un risultato efficace, è indispensabile utilizzare un appropriato pinza caratterizzate da una punta ricurva e seghettata (preferito il formato di punta: il mouse: 0,5 x 0,4 mm ratto: 2,15 x 1,3 mm). La curvatura consente un facile accesso al nervo ottico dopo spostamento bulbo oculare ed è necessaria per il posizionamento corretto mano durante l'esecuzione dei movimenti circolari. Punte lisce non sono raccomandati in quanto manca il grip necessario quando si tiene il nervo ottico. La mancata tenere il nervo ottico correttamente durante i movimenti circolari provoca rottura dell'arteria oftalmica, scarsa distacco dell'occhio e quindi scarsa riproducibilità.Pertanto, si raccomanda di prima pratica questa tecnica su animali eutanasia per l'ottimizzazione delle pinze di movimentazione in modo da garantire la massima protezione degli animali una volta che l'applicazione del metodo in vivo. Enucleazione dell'occhio successo è stato recentemente eseguito anche nel ratto nel nostro laboratorio utilizzando la stessa tecnica tranne per trasformare il corpo animale manualmente e mantenere la pinza stazionaria.
Una limitazione di questa tecnica è che si potrebbe danneggiare la retina. Pertanto questo metodo è meno adatto per la raccolta retine effettuare istologia 5. Inoltre, il nostro metodo è limitato a postare l'apertura dell'occhio secoli da quando il bulbo oculare deve essere spostato dalla presa, senza asportazione o il taglio delle palpebre.
Enucleazione dell'occhio in diverse specie, tra cui roditori, viene eseguita di routine con metodi alternativi, che spesso comportano la rimozione delle palpebre e il taglio del nervo ottico 18,23-25. Questi Methods tendono ad essere più invasivi e hanno una curva di apprendimento superiore alla tecnica qui descritta. Senza la necessità di rimuovere o sutura delle palpebre, il tempo di recupero post intervento chirurgico è ridotto al minimo, con conseguente incremento del benessere degli animali e risultati più riproducibili.
The authors have nothing to disclose.
We thank Ellen Ytebrouck for her valuable information regarding method application in rat. This work was supported by the Research Council of the KU Leuven (OT09/22) and the Fund for Scientific Research-Flanders (FWO Vlaanderen). Jeroen Aerts is supported by a Ph.D. fellowship of the Agency for Innovation through Science and Technology Flanders (IWT Vlaanderen) and Julie Nys by a Ph.D. grant from FWO Flanders.
Ketamine hydrochloride (Anesketin) | Dechra Veterinary Products (Eurovet) | BE-V136516 | |
Medetomidine hydrochloride (Domitor) | Orion Corporation (Janssen Animal Health) | BE-V151742 | |
Atipamezol hydrochloride (Antisedan) | Orion Corporation (Elanco Animal Health) | BE-V153352 | |
Meloxicam (Metacam) | Boehringer Ingelheim Vetmedica | N/A | |
Eye ointment (Fucithalmic) | Leo Pharma nv-sa | BE 144654 | |
Moria MC31 Forceps – Serrated Curved | Fine Science Tools | 11370-31 | For application in the mouse. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated. |
Narrow Pattern Forceps – Curved | Fine Science Tools | 11003-13 | For application in the rat. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated. |
Hemostatic cotton wool | Qualiphar | N/A | Other hemostatic agents are equally suitable (e.g. Viscostat, #649, Ultradent Products) |