من بقعة 2DE جل لوظيفة البروتين: الدرس المستفاد من HS1 في سرطان الدم الليمفاوي المزمن
Summary
نحن هنا وصف البروتوكول الذي الأزواج اثنين من التقنيات البروتين، وهما 2 الأبعاد الكهربائي (2DE) والطيف الكتلي (MS)، لتحديد أعرب تفاضلي / البروتينات المعدلة بعد متعدية بين اثنين أو أكثر من مجموعات من العينات الأولية. هذا النهج، جنبا إلى جنب مع التجارب الفنية، ويسمح للتحديد وتوصيف علامات / الأهداف العلاجية النذير.
Abstract
تحديد جزيئات تشارك في بدء الورم والتقدم هو أمر أساسي لفهم البيولوجيا المرض و، نتيجة لذلك، لإدارة السريرية للمرضى. في العمل الحالي سنقوم بشرح النهج بروتيوميك الأمثل للتعرف على الجزيئات المعنية في تطور سرطان الدم الليمفاوي المزمن (CLL). في التفاصيل، يتم حلها لست] خلية اللوكيميا بنسبة 2 الأبعاد الكهربائي (2DE) وتصور على أنها "البقع" على المواد الهلامية 2DE. تحليل مقارن لخرائط البروتين يسمح تحديد البروتينات وأعرب تفاضلي (من حيث وفرة والتعديلات بعد متعدية) التي يتم انتقاؤها، معزولة والتي حددها الطيف الكتلي (MS). ويمكن اختبار وظيفة بيولوجية من المرشحين حددها فحوصات مختلفة (أي الهجرة، والتصاق البلمرة F-أكتين)، التي قمنا الأمثل لخلايا اللوكيميا الأولية.
Introduction
سرطان الدم الليمفاوي المزمن (CLL)، وسرطان الدم البالغين الأكثر شيوعا في الدول الغربية، مستمد من تراكم حيدة النسيلة الأورام الليمفاوية B + CD5 هو سريريا وغير متجانس جدا. قد تكون موجودة كشكل من أشكال ما قبل بابيضاض الدم، الذي يعرف بأنه الليمفاوية B-خلية وحيدة النسيلة (MBL) 1،2،3. في حالات أخرى يمكن أن يظهر المرض إما مع مسارا سريريا المتراخي، التي يمكن أن تبقى مستقرة لسنوات قبل أن تحتاج العلاج، أو كمرض chemorefractory التدريجي مع التشخيص الكئيب رغم العلاج. أخيرا، قد تقدم إلى سرطان الغدد الليمفاوية وارتفاع درجة قاتلة في كثير من الأحيان (متلازمة-RS ريختر) 2،3،4. عادة ما يتم تصنيف المرضى في اثنين من مجموعات فرعية رئيسية هي: التشخيص الجيد والسيئ، استنادا إلى مجموعة من العوامل النذير الذي يقدم معلومات تكميلية بشأن تنبؤ من نتائج المرض والبقاء على قيد الحياة. الأرجح يعكس عدم التجانس السريرية التجانس البيولوجي. وهناك عدد من الوراثية، microenvironmental وموقد تبين أن العوامل llular لنتفق على التسبب بالمرض رغم عدم وجود آليات موحدة تم العثور على 5. في التفاصيل، وقد أثبتت العديد من الدراسات أن الاختلافات في سياق السريرية للمرض يمكن تفسيره جزئيا من خلال وجود (أو غياب) بعض العلامات البيولوجية التي لها قيمة 6،7،8 النذير. وأظهرت هذه البيانات أن فهم أفضل للبيولوجيا المرض يمكن أن توفر تلميحات إضافية للإدارة السريرية لعلم الأمراض، من خلال تحديد كل من علامات النذير والأهداف العلاجية.
الهدف من هذه الورقة هو إظهار كيف يمكن استخدام مزيج من البروتين تقنيات مختلفة لتحديد البروتينات المشاركة في بداية CLL والتقدم. نهجنا يوضح أنه من الممكن للانضمام معا البروتين الأساسي والبيانات السريرية 5.
في العمل الحالي، خلايا اللوكيميا الأولية من المرضى المختارين(جيد مقابل التكهن سيئة) هي معزولة ومن ثم يتم استخدام الخلية لست] للحصول على خرائط البروتين. 2DE يسمح توصيف للوضع بروتيوميك من سكان الخلية، بما في ذلك التعديلات بعد متعدية، وبالتالي إعطاء معلومات غير المباشرة على النشاط البيولوجي من كل من البروتين. يتم حلها لست] خلية كاملة قبل أول المدى البعد على أساس نقطة تساوي الكهربية، يليه البعد الثاني تعمل على هلام بولي أكريلاميد الذي يحل البروتينات على أساس الوزن الجزيئي. تحليل مقارن لخرائط البروتين يسمح تحديد البروتينات وأعرب تفاضلي (سواء من حيث الوفرة والتعديلات بعد متعدية) كبقع على هلام التي يمكن أن تقطع وتحليلها بواسطة الطيف الكتلي. دور كل مرشح ثم يمكن استغلالها من قبل فحوصات مختلفة.
هذا النهج الذي يقتصر CLL في المخطوطة الحالية، يمكن توسيعها بسهولة إلى أمراض أخرى / عينات، وبالتالي توفير المعلومات حول proteomiج / الاختلافات البيولوجية بين مجموعتين (أي مرضية مقابل المعتاد، مقابل حفز unstimulated والبرية من نوع مقابل ضربة قاضية).
Protocol
Representative Results
Discussion
والهدف من هذا المخطوط هو وصف بروتوكول الأمثل لتحديد جزيئات تشارك في التسبب في CLL، حتى لو كان يمكن تمديد هذا النهج لأمراض أخرى و / أو أنواع أخرى عينة 16-18. بمقارنة ملامح البروتين من 2 مجموعات فرعية من المرضى CLL، وحسن مقابل التكهن سيئة 19، أثبتنا أن اختلف…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر اللمفاوية وحدة الأورام الخبيثة، إليسا عشرة هاكن، ليديا Scarfò، ماسيمو اليسيو، أنطونيو كونتي، أنجيلا باتشي، وأنجيلا كاتانيو.
وأيد هذا المشروع من قبل: Associazione الإيطالية في لا يسر كل من Ricerca سول Cancro جنة العلاقات الصناعية الاسترالية (باحث غرانت والبرنامج الخاص الجزيئية علم الأورام السريري – 5 بالألف # 9965)
CS وBA تصميم الدراسة، إجراء التجارب، وتحليل البيانات، وكتب المخطوطة. MTSB، UR، FBPR ساعد في كتابة المخطوطة. PG وFCC تصميم عينات الدراسة المقدمة للمرضى والبيانات السريرية.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Acetonitril | MERCK | 61830025001730 | |
| Ammonium Bicarbonate | SIGMA | A6141-500G | |
| 1,4-Dithioerythritol | SIGMA | D9680-5G | |
| Iodoacetamide | SIGMA | I6125-25G | |
| Calcium chloride dihydrate | SIGMA | 223506-25G | |
| Trypsin, Sequencing Grade | ROCHE | 11418475001 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | SIGMA | C2020-10G | |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA | T6580 | |
| ZipTipµ-C18 | MILLIPORE | ZTC18M096 | |
| RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL | 15064 | |
| PBS | EUROCLONE | ECB4004L | |
| FBS | DOMINIQUE DUTSCHER | S1810 | |
| Lymphoprep | SENTINEL DIAGNOSTICS | 1114547 | |
| Trypan Blue | SIGMA | T8154 | |
| CD19 | BECKMAN COULTER | 082A07770 | ECD |
| CD5 | BECKMAN COULTER | 082A07754 | PC5 |
| CD3 | BECKMAN COULTER | 082A07746 | FITC |
| CD14 | BD | 345785 | PE |
| CD16 | BECKMAN COULTER | 082A07767 | PC5 |
| CD56 | BECKMAN COULTER | 082A07789 | PC5 |
| Ettan IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit | GE-Healthcare | 11-0033-64 | |
| Urea | SIGMA | U6504 | |
| Tris-Hcl Buffer | BIO-RAD | 161-0799 | |
| CHAPS | SIGMA | C2020-10G | |
| DTT | SIGMA | D9163-5G | |
| IPGstrips | GE-Healthcare | 17-1233-01 | Linear pH 4-7 18cm |
| IPGbuffer | GE-Healthcare | 17-6000-86 | pH 4-7 |
| Glycerol | SIGMA | G6279 | |
| PROTEAN II XL Cell | BIO-RAD | 165-3188 | |
| SDS | INVITROGEN | NP0001 | |
| Acrilamide | BIO-RAD | 161-0156 | |
| Agarosio | INVITROGEN | 16500 | |
| Methanol | SIGMA | 32213 | |
| Acetic Acid | VWR | 631000 | |
| Formalin | BIO-OPTICAL | 05-K01009 | |
| Ethanol | VWR | 9832500 | |
| Sodium Thiosulfate | FLUKA | 72049 | |
| Silver Nitrate | FLUKA | 85228 | |
| Molecular Dynamics Personal SI Laser Densitometer | Amersham Biosciences | ||
| ImageMaster 2D Platinum 5.0 | Amersham Biosciences | ||
| Sodium Carbonate | MERCK | A0250292 | |
| MALDI-TOF Voyager-DE STR | Applied Biosystems | ||
| Data Explorer software (version 3.2) | Applied Biosystems | ||
| transwell chambre 6.6 mm diameter | CORNING | 3421 | |
| RPMI | EUROCLONE | ECB2000L | WITH L-GLUTAMINE |
| Gentamicin | SIGMA | G1397 | |
| SDF-1 | PREPROTECH | 300-28A | |
| Flat-bottom 96-well plate | BECTON DICKINSON | 353072 | |
| BSA | SANTA CRUZ | 9048-46-8 | |
| ICAM-1 | R&D Systems | 720-IC | |
| CMFDA | Life Thechnology | C7025 | Green |
| IgM | SOUTHERNBIOTECH | 2020-02 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA | P6148 | |
| Saponine | SIGMA | S-7900 | |
| Phalloidin | Life Thechnology | A12379 | Alexa fluor 488 |
Riferimenti
- Caligaris-Cappio, F., Ghia, P. Novel insights in chronic lymphocytic leukemia: are we getting closer to understanding the pathogenesis of the disease. J Clin Oncol. 26, 4497-4503 (2008).
- Rawstron, A. C., et al. Monoclonal B-cell lymphocytosis and chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med. 359, 575-583 (2008).
- Dagklis, A., Fazi, C., Scarfo, L., Apollonio, B., Ghia, P. Monoclonal B lymphocytosis in the general population. Leuk Lymphoma. 50, 490-492 (2009).
- Fazi, C., et al. General population low-count CLL-like MBL persists over time without clinical progression, although carrying the same cytogenetic abnormalities of CLL. Blood. 118, 6618-6625 (2011).
- Caligaris-Cappio, F., Bertilaccio, M. T., Scielzo, C. How the microenvironment wires the natural history of chronic lymphocytic leukemia. Seminars in cancer biology. , (2013).
- Damle, R. N., et al. Ig V gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 94, 1840-1847 (1999).
- Lanham, S., et al. Differential signaling via surface IgM is associated with VH gene mutational status and CD38 expression in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 101, 1087-1093 (2003).
- Wiestner, A., et al. ZAP-70 expression identifies a chronic lymphocytic leukemia subtype with unmutated immunoglobulin genes, inferior clinical outcome, and distinct gene expression profile. Blood. 101, 4944-4951 (2003).
- Mulligan, C. S., Thomas, M. E., Mulligan, S. P. Lymphocytes, B lymphocytes, and clonal CLL cells: observations on the impact of the new diagnostic criteria in the 2008 Guidelines for Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL). Blood. 113, 6496-6497 (2009).
- Conti, A., et al. Proteome study of human cerebrospinal fluid following traumatic brain injury indicates fibrin(ogen) degradation products as trauma-associated markers. J Neurotrauma. 21, 854-863 (2004).
- Mortz, E., Krogh, T. N., Vorum, H., Gorg, A. Improved silver staining protocols for high sensitivity protein identification using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight analysis. Proteomics. 1, 1359-1363 (2001).
- Zhang, W., Chait, B. T. ProFound: an expert system for protein identification using mass spectrometric peptide mapping information. Anal Chem. 72, 2482-2489 (2000).
- Scielzo, C., et al. HS1 protein is differentially expressed in chronic lymphocytic leukemia patient subsets with good or poor prognoses. J Clin Invest. 115, 1644-1650 (2005).
- Muzio, M., et al. HS1 complexes with cytoskeleton adapters in normal and malignant chronic lymphocytic leukemia B cells. Leukemia. 21 (9), 2067-2070 (2007).
- Scielzo, C., et al. HS1 has a central role in the trafficking and homing of leukemic B cells. Blood. 116, 3537-3546 (2010).
- Kashuba, E., et al. Proteomic analysis of B-cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukaemia reveals a possible role for kininogen. J Proteomics. 91, 478-485 (2013).
- Dhamoon, A. S., Kohn, E. C., Azad, N. S. The ongoing evolution of proteomics in malignancy. Drug Discov Today. 12, 700-708 (2007).
- Ummanni, R., et al. Identification of clinically relevant protein targets in prostate cancer with 2D-DIGE coupled mass spectrometry and systems biology network platform. PLoS One. 6, (2011).
