प्रोटीन समारोह के लिए एक 2DE जेल मौके से: क्रोनिक लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया में HS1 से सीखा सबक
Summary
यहाँ हम जोड़ों के दो प्रोटीयोमिक तकनीक, अर्थात् वैद्युतकणसंचलन (2DE) और मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) 2 आयामी, विभिन्न प्राथमिक नमूनों में से दो या अधिक समूहों के बीच / बाद translational संशोधित प्रोटीन व्यक्त की पहचान कर सकते हैं कि एक प्रोटोकॉल का वर्णन. यह दृष्टिकोण, एक साथ कार्यात्मक प्रयोगों के साथ, शकुन मार्करों / चिकित्सकीय लक्ष्यों की पहचान और लक्षण वर्णन की अनुमति देता है.
Abstract
ट्यूमर दीक्षा और प्रगति में शामिल अणुओं की पहचान रोगियों के नैदानिक प्रबंधन के लिए, एक परिणाम के रूप में, समझ रोग के जीव विज्ञान के लिए मौलिक है और. वर्तमान काम में हम पुरानी लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया (CLL) की प्रगति में शामिल अणुओं की पहचान के लिए एक अनुकूलित प्रोटिओमिक दृष्टिकोण का वर्णन करेंगे. विस्तार में, लुकेमिक सेल lysates 2 आयामी वैद्युतकणसंचलन (2DE) द्वारा हल कर रहे हैं और 2DE जैल पर "स्पॉट 'के रूप में कल्पना की. प्रोटिओमिक नक्शे का तुलनात्मक विश्लेषण मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) द्वारा पृथक, उठाया और पहचान कर रहे हैं कि (बहुतायत और बाद translational संशोधनों के संदर्भ में) विभिन्न व्यक्त प्रोटीन की पहचान की अनुमति देता. पहचान उम्मीदवारों की जैविक समारोह हम प्राथमिक leukemic कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया है कि, विभिन्न assays (यानी प्रवास, आसंजन और एफ actin polymerization) द्वारा परीक्षण किया जा सकता है.
Introduction
क्रोनिक लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया (CLL), पश्चिमी देशों में सबसे आम वयस्क ल्यूकेमिया, मोनोक्लोनल नियोप्लास्टिक CD5 + बी लिम्फोसाइटों के संचय से निकला और नैदानिक बहुत विषम है. यह मोनोक्लोनल बी सेल lymphocytosis (एमबीएल) 1,2,3 के रूप में परिभाषित एक पूर्व लयूकेमिक रूप है, के रूप में मौजूद हो सकता है. रोग या तो एक अकर्मण्य नैदानिक पाठ्यक्रम के साथ दिखाई दे सकते हैं अन्य मामलों में, कि इलाज की जरूरत से पहले साल के लिए स्थिर रह सकता है, या निराशाजनक पूर्वानुमान के साथ एक प्रगतिशील chemorefractory बीमारी के रूप में चिकित्सा के बावजूद. अंत में, यह एक अक्सर घातक उच्च ग्रेड लिंफोमा (रिक्टर सिंड्रोम रु) 2,3,4 में प्रगति कर सकते हैं. अच्छा और बुरा रोग का निदान, रोग परिणाम और अस्तित्व के भविष्यवक्ताओं पर पूरक जानकारी प्रदान करता है कि शकुन कारकों में से एक सेट पर आधारित: मरीजों को आमतौर पर दो मुख्य कैंपेन्स में वर्गीकृत किया जाता है. क्लीनिकल विविधता संभावना जैविक विविधता को दर्शाता है. आनुवंशिक, microenvironmental और CE की संख्याllular कारकों कोई एकीकृत तंत्र 5 पाया गया है, हालांकि रोग रोगजनन के लिए सहमत करने के लिए दिखाया गया है. विस्तार में, कई अध्ययनों रोग के नैदानिक पाठ्यक्रम में मतभेद आंशिक रूप से एक शकुन मूल्य 6,7,8 है कि कुछ जैविक मार्कर की उपस्थिति (या अनुपस्थिति) द्वारा समझाया जा सकता है कि प्रदर्शन किया है. इन आंकड़ों रोग जीव विज्ञान की एक बेहतर समझ शकुन मार्करों और चिकित्सीय लक्ष्य दोनों की पहचान करके, विकृति विज्ञान के नैदानिक प्रबंधन के लिए अतिरिक्त संकेत दे सकती है कि प्रदर्शन किया.
वर्तमान कागज के लक्ष्य अलग प्रोटीयोमिक तकनीकों का एक संयोजन CLL शुरुआत और प्रगति में शामिल प्रोटीन की पहचान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है दिखाने के लिए है. हमारा दृष्टिकोण यह एक साथ बुनियादी प्रोटीयोमिक और नैदानिक डेटा 5 में शामिल होने के लिए संभव है कि यह दर्शाता है.
चयनित रोगियों से वर्तमान कार्यप्रवाह में, प्राथमिक leukemic कोशिकाओं(बुरा रोग का निदान बनाम अच्छा) अलग कर रहे हैं और सेल lysates तो प्रोटीयोमिक नक्शे प्राप्त करने के लिए उपयोग किया जाता है. 2DE इस प्रकार प्रत्येक प्रोटीन की जैविक गतिविधि पर अप्रत्यक्ष जानकारी दे रही है, बाद translational संशोधनों सहित एक सेल आबादी के प्रोटीयोमिक प्रोफ़ाइल के लक्षण वर्णन अनुमति देता है. पूरे सेल lysates उनके आणविक वजन के आधार पर प्रोटीन को हल करने वाले एक polyacrylamide जेल पर चलने एक दूसरा आयाम है, जिसके बाद समविद्युतविभव बात पर आधारित एक प्रथम आयाम रन से हल कर रहे हैं. प्रोटिओमिक नक्शे का तुलनात्मक विश्लेषण विभिन्न व्यक्त प्रोटीन की पहचान की अनुमति देता है (दोनों बहुतायत और बाद translational संशोधनों के संदर्भ में) में कटौती और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है कि जेल पर धब्बे के रूप में. प्रत्येक उम्मीदवार की भूमिका तो अलग assays के द्वारा शोषण किया जा सकता है.
वर्तमान पांडुलिपि में CLL के लिए प्रतिबंधित यह दृष्टिकोण, आसानी से इस प्रकार proteomi के बारे में जानकारी प्रदान करने, अन्य बीमारियों / नमूने के लिए विस्तारित किया जा सकता है(पछाड़ना बनाम unstimulated, जंगली प्रकार बनाम प्रेरित सामान्य बनाम वैकृत यानी,) दो समूहों के बीच सी / जैविक मतभेद.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पांडुलिपि का उद्देश्य इस दृष्टिकोण अन्य बीमारियों और / या अन्य प्रकार नमूना 16-18 के लिए बढ़ाया जा सकता है, भले ही CLL के रोगजनन में शामिल अणुओं की पहचान के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन करने के…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम लिम्फायड कैंसर यूनिट, एलिसा दस Hacken, लिडा Scarfò, मास्सिमो Alessio, एंटोनियो कोंटी, एंजेला बच्ची, और एंजेला Cattaneo धन्यवाद.
इस परियोजना के द्वारा समर्थित किया गया था: Associazione Italiana प्रति ला RICERCA सुल Cancro AIRC (अन्वेषक अनुदान और विशेष कार्यक्रम आण्विक नैदानिक कैंसर विज्ञान – 5 सहस्र # प्रति 9965)
सीएस और बीए, अध्ययन डिजाइन किए प्रयोगों का प्रदर्शन, डेटा का विश्लेषण और पांडुलिपि लिखा था. MTSB, यू.आर., FBPR पांडुलिपि लेखन में सहायता प्रदान की. पीजी और एफसीसी अध्ययन प्रदान की मरीजों के नमूने और क्लीनिकल डाटा बनाया गया.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Acetonitril | MERCK | 61830025001730 | |
| Ammonium Bicarbonate | SIGMA | A6141-500G | |
| 1,4-Dithioerythritol | SIGMA | D9680-5G | |
| Iodoacetamide | SIGMA | I6125-25G | |
| Calcium chloride dihydrate | SIGMA | 223506-25G | |
| Trypsin, Sequencing Grade | ROCHE | 11418475001 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | SIGMA | C2020-10G | |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA | T6580 | |
| ZipTipµ-C18 | MILLIPORE | ZTC18M096 | |
| RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL | 15064 | |
| PBS | EUROCLONE | ECB4004L | |
| FBS | DOMINIQUE DUTSCHER | S1810 | |
| Lymphoprep | SENTINEL DIAGNOSTICS | 1114547 | |
| Trypan Blue | SIGMA | T8154 | |
| CD19 | BECKMAN COULTER | 082A07770 | ECD |
| CD5 | BECKMAN COULTER | 082A07754 | PC5 |
| CD3 | BECKMAN COULTER | 082A07746 | FITC |
| CD14 | BD | 345785 | PE |
| CD16 | BECKMAN COULTER | 082A07767 | PC5 |
| CD56 | BECKMAN COULTER | 082A07789 | PC5 |
| Ettan IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit | GE-Healthcare | 11-0033-64 | |
| Urea | SIGMA | U6504 | |
| Tris-Hcl Buffer | BIO-RAD | 161-0799 | |
| CHAPS | SIGMA | C2020-10G | |
| DTT | SIGMA | D9163-5G | |
| IPGstrips | GE-Healthcare | 17-1233-01 | Linear pH 4-7 18cm |
| IPGbuffer | GE-Healthcare | 17-6000-86 | pH 4-7 |
| Glycerol | SIGMA | G6279 | |
| PROTEAN II XL Cell | BIO-RAD | 165-3188 | |
| SDS | INVITROGEN | NP0001 | |
| Acrilamide | BIO-RAD | 161-0156 | |
| Agarosio | INVITROGEN | 16500 | |
| Methanol | SIGMA | 32213 | |
| Acetic Acid | VWR | 631000 | |
| Formalin | BIO-OPTICAL | 05-K01009 | |
| Ethanol | VWR | 9832500 | |
| Sodium Thiosulfate | FLUKA | 72049 | |
| Silver Nitrate | FLUKA | 85228 | |
| Molecular Dynamics Personal SI Laser Densitometer | Amersham Biosciences | ||
| ImageMaster 2D Platinum 5.0 | Amersham Biosciences | ||
| Sodium Carbonate | MERCK | A0250292 | |
| MALDI-TOF Voyager-DE STR | Applied Biosystems | ||
| Data Explorer software (version 3.2) | Applied Biosystems | ||
| transwell chambre 6.6 mm diameter | CORNING | 3421 | |
| RPMI | EUROCLONE | ECB2000L | WITH L-GLUTAMINE |
| Gentamicin | SIGMA | G1397 | |
| SDF-1 | PREPROTECH | 300-28A | |
| Flat-bottom 96-well plate | BECTON DICKINSON | 353072 | |
| BSA | SANTA CRUZ | 9048-46-8 | |
| ICAM-1 | R&D Systems | 720-IC | |
| CMFDA | Life Thechnology | C7025 | Green |
| IgM | SOUTHERNBIOTECH | 2020-02 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA | P6148 | |
| Saponine | SIGMA | S-7900 | |
| Phalloidin | Life Thechnology | A12379 | Alexa fluor 488 |
Riferimenti
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