С 2DE-гель пятна с белком Функция: Урок, извлеченный из HS1 в хронический лимфолейкоз
Summary
Здесь мы опишем протокол, что пары две протеомные методы, а именно 2-мерный электрофорез (2DE) и масс-спектрометрия (MS), чтобы идентифицировать дифференциально экспрессируются / посттрансляционные модифицированные белки между двумя или более группами первичных проб. Этот подход, вместе с функциональными экспериментов, позволяет идентифицировать и охарактеризовать прогностических маркеров / терапевтических мишеней.
Abstract
Идентификация молекул, участвующих в инициации и прогрессировании опухоли имеет основополагающее значение для биологии О развитии заболеваний и, как следствие, для клинического ведения пациентов. В настоящей работе мы опишем оптимизированную протеомный подход для идентификации молекул, участвующих в прогрессировании хронического лимфолейкоза (ХЛЛ). В деталях, лейкозных клеточные лизаты решаются 2-мерном электрофореза (2DE) и визуализируется в виде "пятен" на гелях 2DE. Сравнительный анализ протеомическим карт позволяет идентифицировать разному экспрессируются белки (в плане численности и пост-трансляционных модификаций), которые подобрали, выделены и идентифицированы по масс-спектрометрии (MS). Биологическая функция выявленных кандидатов могут быть проверены различными анализов (то есть миграция, адгезии и F-актин полимеризации), что мы оптимизировали для первичных лейкозных клеток.
Introduction
Хронический лимфолейкоз (ХЛЛ), наиболее распространенным взрослых лейкоз в западных странах, происходит от накопления моноклональных опухолевых CD5 + В-лимфоцитов и клинически очень неоднородна. Это может присутствовать в виде предварительно лейкозных форме, определяемой как моноклональное В-клеток лимфоцитоз (MBL) 1,2,3. В других случаях болезнь может появиться либо безболезненную клинического течения, которые могут оставаться стабильными в течение многих лет, прежде чем, нуждающихся в лечении, или как прогрессирующее заболевание chemorefractory с плохим прогнозом, несмотря на лечение. Наконец, это может прогрессировать в часто смертельной высококачественной лимфомы (Рихтера синдром-RS) 2,3,4. Пациенты обычно классифицируются по двум основным подмножества: хорошего и плохого прогноза, на основе набора прогностических факторов, который обеспечивает дополнительную информацию о предикторы исхода заболевания и выживаемость. Клиническая гетерогенность, вероятно, отражает биологическую гетерогенность. Ряд генетических, микросреды и сеllular факторы, как было показано согласны с патогенезе заболевания хотя никаких объединительные механизмы не были найдены 5. В деталях, некоторые исследования показали, что различия в клиническом течении заболевания может быть частично объяснено наличием (или отсутствием) некоторых биологических маркеров, которые имеют прогностическое значение 6,7,8. Эти данные показали, что лучшее понимание биологии заболевания может обеспечить дополнительные подсказки для клинического ведения патологии, путем идентификации обоих прогностических маркеров и терапевтических мишеней.
Целью настоящей работы является показать, как сочетание различных протеомных методов может быть использован для идентификации белков, участвующих в ХЛЛ возникновения и прогрессирования. Наш подход показывает, что можно объединить вместе основную протеомические и клинических данных 5.
В настоящем рабочем процессе, первичные лейкозных клеток из отобранных пациентов(Хорошо против плохим прогнозом) изолированы и клеточные лизаты затем используются для получения протеомные карты. 2DE позволяет характеризовать протеомного профайл клеточной популяции, в том числе пост-трансляционных модификаций, тем самым давая косвенную информацию о биологической активности каждого белка. Цельные клеточные лизаты решаются с помощью первого размерности перспективе на основе изоэлектрической точки, за которым следует второй измерении работать на полиакриламидном геле, который разрешает белков в зависимости от их молекулярной массы. Сравнительный анализ протеомическим карт позволяет идентифицировать разному экспрессируются белки (как с точки зрения численности и пост-трансляционных модификаций) в качестве мест на гель, который можно вырезать и анализировали с помощью масс-спектрометрии. Роль каждого кандидата можно затем эксплуатируются различными анализов.
Этот подход, ограничивается ХЛЛ в текущем рукописи, может быть легко расширена для других заболеваний / образцов, таким образом, обеспечивая информацию о proteomiC / биологические различия между двумя группами (т.е. патологические против нормальной, стимулированные против нестимулированной, дикого типа против нокдаун).
Protocol
Representative Results
Discussion
Цель этой рукописи является описание оптимизированный протокол для идентификации молекул, вовлеченных в патогенез ХЛЛ, даже если этот подход может быть распространен на другие заболевания и / или других типов образцов 16-18. Сравнивая протеомные профили 2 подмножеств ХЛЛ, хорош…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим лимфоидных злокачественных новообразований Unit, Elisa десять Хакен, Лидия Скарфо, Массимо Алессио, Антонио Конти, Анджела Бачи и Ангела Cattaneo.
Этот проект был поддержан: Associazione Italiana за ла Ricerca суль Cancro AIRC (следователь Грант и Специальная программа молекулярной клинической онкологии – 5 промилле # 9965)
CS и BA предназначен исследование, выполнили эксперименты, проанализированы данные и написал рукопись. MTSB, UR, FBPR помощь в написании рукописи. PG и FCC разработаны образцы исследование дало пациентов и клинические данные.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Acetonitril | MERCK | 61830025001730 | |
| Ammonium Bicarbonate | SIGMA | A6141-500G | |
| 1,4-Dithioerythritol | SIGMA | D9680-5G | |
| Iodoacetamide | SIGMA | I6125-25G | |
| Calcium chloride dihydrate | SIGMA | 223506-25G | |
| Trypsin, Sequencing Grade | ROCHE | 11418475001 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | SIGMA | C2020-10G | |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA | T6580 | |
| ZipTipµ-C18 | MILLIPORE | ZTC18M096 | |
| RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL | 15064 | |
| PBS | EUROCLONE | ECB4004L | |
| FBS | DOMINIQUE DUTSCHER | S1810 | |
| Lymphoprep | SENTINEL DIAGNOSTICS | 1114547 | |
| Trypan Blue | SIGMA | T8154 | |
| CD19 | BECKMAN COULTER | 082A07770 | ECD |
| CD5 | BECKMAN COULTER | 082A07754 | PC5 |
| CD3 | BECKMAN COULTER | 082A07746 | FITC |
| CD14 | BD | 345785 | PE |
| CD16 | BECKMAN COULTER | 082A07767 | PC5 |
| CD56 | BECKMAN COULTER | 082A07789 | PC5 |
| Ettan IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit | GE-Healthcare | 11-0033-64 | |
| Urea | SIGMA | U6504 | |
| Tris-Hcl Buffer | BIO-RAD | 161-0799 | |
| CHAPS | SIGMA | C2020-10G | |
| DTT | SIGMA | D9163-5G | |
| IPGstrips | GE-Healthcare | 17-1233-01 | Linear pH 4-7 18cm |
| IPGbuffer | GE-Healthcare | 17-6000-86 | pH 4-7 |
| Glycerol | SIGMA | G6279 | |
| PROTEAN II XL Cell | BIO-RAD | 165-3188 | |
| SDS | INVITROGEN | NP0001 | |
| Acrilamide | BIO-RAD | 161-0156 | |
| Agarosio | INVITROGEN | 16500 | |
| Methanol | SIGMA | 32213 | |
| Acetic Acid | VWR | 631000 | |
| Formalin | BIO-OPTICAL | 05-K01009 | |
| Ethanol | VWR | 9832500 | |
| Sodium Thiosulfate | FLUKA | 72049 | |
| Silver Nitrate | FLUKA | 85228 | |
| Molecular Dynamics Personal SI Laser Densitometer | Amersham Biosciences | ||
| ImageMaster 2D Platinum 5.0 | Amersham Biosciences | ||
| Sodium Carbonate | MERCK | A0250292 | |
| MALDI-TOF Voyager-DE STR | Applied Biosystems | ||
| Data Explorer software (version 3.2) | Applied Biosystems | ||
| transwell chambre 6.6 mm diameter | CORNING | 3421 | |
| RPMI | EUROCLONE | ECB2000L | WITH L-GLUTAMINE |
| Gentamicin | SIGMA | G1397 | |
| SDF-1 | PREPROTECH | 300-28A | |
| Flat-bottom 96-well plate | BECTON DICKINSON | 353072 | |
| BSA | SANTA CRUZ | 9048-46-8 | |
| ICAM-1 | R&D Systems | 720-IC | |
| CMFDA | Life Thechnology | C7025 | Green |
| IgM | SOUTHERNBIOTECH | 2020-02 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA | P6148 | |
| Saponine | SIGMA | S-7900 | |
| Phalloidin | Life Thechnology | A12379 | Alexa fluor 488 |
Riferimenti
- Caligaris-Cappio, F., Ghia, P. Novel insights in chronic lymphocytic leukemia: are we getting closer to understanding the pathogenesis of the disease. J Clin Oncol. 26, 4497-4503 (2008).
- Rawstron, A. C., et al. Monoclonal B-cell lymphocytosis and chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med. 359, 575-583 (2008).
- Dagklis, A., Fazi, C., Scarfo, L., Apollonio, B., Ghia, P. Monoclonal B lymphocytosis in the general population. Leuk Lymphoma. 50, 490-492 (2009).
- Fazi, C., et al. General population low-count CLL-like MBL persists over time without clinical progression, although carrying the same cytogenetic abnormalities of CLL. Blood. 118, 6618-6625 (2011).
- Caligaris-Cappio, F., Bertilaccio, M. T., Scielzo, C. How the microenvironment wires the natural history of chronic lymphocytic leukemia. Seminars in cancer biology. , (2013).
- Damle, R. N., et al. Ig V gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 94, 1840-1847 (1999).
- Lanham, S., et al. Differential signaling via surface IgM is associated with VH gene mutational status and CD38 expression in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 101, 1087-1093 (2003).
- Wiestner, A., et al. ZAP-70 expression identifies a chronic lymphocytic leukemia subtype with unmutated immunoglobulin genes, inferior clinical outcome, and distinct gene expression profile. Blood. 101, 4944-4951 (2003).
- Mulligan, C. S., Thomas, M. E., Mulligan, S. P. Lymphocytes, B lymphocytes, and clonal CLL cells: observations on the impact of the new diagnostic criteria in the 2008 Guidelines for Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL). Blood. 113, 6496-6497 (2009).
- Conti, A., et al. Proteome study of human cerebrospinal fluid following traumatic brain injury indicates fibrin(ogen) degradation products as trauma-associated markers. J Neurotrauma. 21, 854-863 (2004).
- Mortz, E., Krogh, T. N., Vorum, H., Gorg, A. Improved silver staining protocols for high sensitivity protein identification using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight analysis. Proteomics. 1, 1359-1363 (2001).
- Zhang, W., Chait, B. T. ProFound: an expert system for protein identification using mass spectrometric peptide mapping information. Anal Chem. 72, 2482-2489 (2000).
- Scielzo, C., et al. HS1 protein is differentially expressed in chronic lymphocytic leukemia patient subsets with good or poor prognoses. J Clin Invest. 115, 1644-1650 (2005).
- Muzio, M., et al. HS1 complexes with cytoskeleton adapters in normal and malignant chronic lymphocytic leukemia B cells. Leukemia. 21 (9), 2067-2070 (2007).
- Scielzo, C., et al. HS1 has a central role in the trafficking and homing of leukemic B cells. Blood. 116, 3537-3546 (2010).
- Kashuba, E., et al. Proteomic analysis of B-cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukaemia reveals a possible role for kininogen. J Proteomics. 91, 478-485 (2013).
- Dhamoon, A. S., Kohn, E. C., Azad, N. S. The ongoing evolution of proteomics in malignancy. Drug Discov Today. 12, 700-708 (2007).
- Ummanni, R., et al. Identification of clinically relevant protein targets in prostate cancer with 2D-DIGE coupled mass spectrometry and systems biology network platform. PLoS One. 6, (2011).
