A partir de um ponto 2DE-Gel para a função da proteína: lição aprendida com HS1 em leucemia linfocítica crônica
Summary
Aqui nós descrevemos um protocolo que os casais duas técnicas proteômicas, ou seja, 2-dimensional Eletroforese (2DE) e Espectrometria de Massa (MS), para identificar diferencialmente expressos / proteínas pós-traducionais modificados entre dois ou mais grupos de amostras primárias. Esta abordagem, em conjunto com ensaios funcionais, permite a identificação e caracterização de marcadores / alvos terapêuticos prognósticos.
Abstract
A identificação de moléculas envolvidas na iniciação e progressão tumoral é fundamental para a biologia da doença compreensão e, como conseqüência, para o manejo clínico dos pacientes. No presente trabalho, vamos descrever uma abordagem proteómica optimizado para a identificação de moléculas envolvidas na progressão da leucemia linfocítica crónica (CLL). Em detalhe, os lisados de células leucémicas são resolvidos por 2-dimensional Electrophoresis (2DE) e visualizada como "manchas" nos géis 2DE. A análise comparativa de mapas de proteómica permite a identificação de proteínas diferencialmente expressas (em termos de abundância e modificações pós-tradução), que são escolhidos, isolados e identificados por espectrometria de massa (MS). A função biológica dos candidatos identificados podem ser testados por ensaios diferentes (isto é, migração, adesão e polimerização de F-actina), que optimizaram para células leucémicas primárias.
Introduction
Leucemia Linfocítica Crônica (LLC), a leucemia em adultos mais comum nos países ocidentais, deriva do acúmulo de linfócitos CD5 + B neoplásicas monoclonais e é clinicamente muito heterogêneo. Pode estar presente como uma forma de pré-leucémicas, definido como linfoma de células B monoclonais (MBL) 1,2,3. Em outros casos, a doença pode aparecer com um curso clínico indolente, que pode permanecer estável durante anos antes de precisar de tratamento, ou como uma doença chemorefractory progressiva com prognóstico sombrio, apesar da terapêutica. Finalmente, pode evoluir para um linfoma de alto grau freqüentemente letal (Síndrome de Richter-RS) 2,3,4. Os pacientes são geralmente classificados em dois subgrupos principais: bom e mau prognóstico, com base em um conjunto de fatores prognósticos que fornece informações complementares sobre preditores de prognóstico da doença e sobrevivência. A heterogeneidade clínica provavelmente reflete a heterogeneidade biológica. Um número de genética, microambiental e cellular factores têm sido mostrados para concorrer para a patogênese da doença, embora não há mecanismos unificadores foram encontrados 5. Em detalhe, vários estudos têm demonstrado que as diferenças no curso clínico da doença pode ser parcialmente explicado pela presença (ou ausência) de alguns marcadores biológicos que têm um valor 6,7,8 prognóstico. Estes dados demonstram que uma melhor compreensão da biologia da doença poderia fornecer dicas adicionais para o manejo clínico da patologia, através da identificação de ambos os marcadores prognósticos e alvos terapêuticos.
O objetivo do presente trabalho é mostrar como a combinação de diferentes técnicas proteômicas pode ser utilizado para a identificação de proteínas envolvidas no aparecimento e progressão CLL. Nossa abordagem demonstra que é possível juntar proteômica juntos básica e dados clínicos 5.
No presente do fluxo de trabalho, as células leucêmicas primários de pacientes selecionados(Bom contra o mau prognóstico) são isoladas e lisados celulares são usados para obter mapas de proteômica. 2DE permite caracterizar o perfil de proteómica de uma população de células, incluindo modificações pós-tradução, assim dando informações indirectas sobre a actividade biológica de cada proteína. Os lisados celulares totais são resolvidos por uma primeira dimensão de execução com base no ponto isoeléctrico, seguido por uma segunda dimensão corridos num gel de poliacrilamida que resolve as proteínas com base no seu peso molecular. A análise comparativa de mapas de proteómica permite a identificação de proteínas diferencialmente expressas (tanto em termos de abundância e modificações pós-tradução), como pontos do gel que podem ser cortados e analisados por Espectrometria de Massa. O papel de cada candidato pode ser explorado em seguida, por diferentes ensaios.
Esta abordagem, restrito a CLL no manuscrito atual, pode ser facilmente expandido para outras doenças / amostras, fornecendo assim informações sobre o proteomic / diferenças biológicas entre dois grupos (ie patológicas vs normais, estimuladas vs não estimulada, do tipo selvagem vs knockdown).
Protocol
Representative Results
Discussion
O objectivo deste artigo é descrever um protocolo optimizado para a identificação de moléculas envolvidas na patogénese de CLL, mesmo que esta abordagem possa ser estendida a outras doenças e / ou outros tipos de amostras 16-18. Ao comparar os perfis de proteómica dois grupos de pacientes com LLC, boas vs mau prognóstico 19, demonstrou-se que eles diferem no estado de fosforilação de HS1 que a sua activação e afecta a capacidade de adesão e migração de células leucém…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Malignancies Unidade linfóide, Elisa dez Hacken, Lydia Scarfo, Massimo Alessio, Antonio Conti, Angela Bachi, e Angela Cattaneo.
Este projecto foi apoiado por: Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro AIRC (Investigator Grant e Programa Especial Molecular Oncologia Clínica – 5 por mille # 9965)
CS e BA projetou o estudo, realizou os experimentos, analisaram os dados e escreveu o manuscrito. MTSB, UR, FBPR assistida por escrito o manuscrito. PG e FCC projetado amostras O estudo proporcionou dos pacientes e dados clínicos.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Acetonitril | MERCK | 61830025001730 | |
| Ammonium Bicarbonate | SIGMA | A6141-500G | |
| 1,4-Dithioerythritol | SIGMA | D9680-5G | |
| Iodoacetamide | SIGMA | I6125-25G | |
| Calcium chloride dihydrate | SIGMA | 223506-25G | |
| Trypsin, Sequencing Grade | ROCHE | 11418475001 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | SIGMA | C2020-10G | |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA | T6580 | |
| ZipTipµ-C18 | MILLIPORE | ZTC18M096 | |
| RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL | 15064 | |
| PBS | EUROCLONE | ECB4004L | |
| FBS | DOMINIQUE DUTSCHER | S1810 | |
| Lymphoprep | SENTINEL DIAGNOSTICS | 1114547 | |
| Trypan Blue | SIGMA | T8154 | |
| CD19 | BECKMAN COULTER | 082A07770 | ECD |
| CD5 | BECKMAN COULTER | 082A07754 | PC5 |
| CD3 | BECKMAN COULTER | 082A07746 | FITC |
| CD14 | BD | 345785 | PE |
| CD16 | BECKMAN COULTER | 082A07767 | PC5 |
| CD56 | BECKMAN COULTER | 082A07789 | PC5 |
| Ettan IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit | GE-Healthcare | 11-0033-64 | |
| Urea | SIGMA | U6504 | |
| Tris-Hcl Buffer | BIO-RAD | 161-0799 | |
| CHAPS | SIGMA | C2020-10G | |
| DTT | SIGMA | D9163-5G | |
| IPGstrips | GE-Healthcare | 17-1233-01 | Linear pH 4-7 18cm |
| IPGbuffer | GE-Healthcare | 17-6000-86 | pH 4-7 |
| Glycerol | SIGMA | G6279 | |
| PROTEAN II XL Cell | BIO-RAD | 165-3188 | |
| SDS | INVITROGEN | NP0001 | |
| Acrilamide | BIO-RAD | 161-0156 | |
| Agarosio | INVITROGEN | 16500 | |
| Methanol | SIGMA | 32213 | |
| Acetic Acid | VWR | 631000 | |
| Formalin | BIO-OPTICAL | 05-K01009 | |
| Ethanol | VWR | 9832500 | |
| Sodium Thiosulfate | FLUKA | 72049 | |
| Silver Nitrate | FLUKA | 85228 | |
| Molecular Dynamics Personal SI Laser Densitometer | Amersham Biosciences | ||
| ImageMaster 2D Platinum 5.0 | Amersham Biosciences | ||
| Sodium Carbonate | MERCK | A0250292 | |
| MALDI-TOF Voyager-DE STR | Applied Biosystems | ||
| Data Explorer software (version 3.2) | Applied Biosystems | ||
| transwell chambre 6.6 mm diameter | CORNING | 3421 | |
| RPMI | EUROCLONE | ECB2000L | WITH L-GLUTAMINE |
| Gentamicin | SIGMA | G1397 | |
| SDF-1 | PREPROTECH | 300-28A | |
| Flat-bottom 96-well plate | BECTON DICKINSON | 353072 | |
| BSA | SANTA CRUZ | 9048-46-8 | |
| ICAM-1 | R&D Systems | 720-IC | |
| CMFDA | Life Thechnology | C7025 | Green |
| IgM | SOUTHERNBIOTECH | 2020-02 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA | P6148 | |
| Saponine | SIGMA | S-7900 | |
| Phalloidin | Life Thechnology | A12379 | Alexa fluor 488 |
Riferimenti
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