D'un spot 2DE-Gel de la fonction des protéines: Leçons apprises De HS1 dans la leucémie lymphoïde chronique
Summary
Nous décrivons ici un protocole que les couples deux techniques de protéomique, à savoir 2 dimensions électrophorèse (2DE) et la spectrométrie de masse (MS), d'identifier exprimés de manière différentielle / protéines modifiées post-traductionnelles entre deux ou plusieurs groupes d'échantillons primaires. Cette approche, avec des expériences fonctionnelles, permet l'identification et la caractérisation de marqueurs / cibles thérapeutiques pronostiques.
Abstract
L'identification des molécules impliquées dans l'initiation et la progression de la tumeur est essentielle à la compréhension de la biologie de la maladie et, en conséquence, pour la prise en charge clinique des patients. Dans le présent travail, nous allons décrire une approche protéomique optimisé pour l'identification des molécules impliquées dans la progression de la leucémie lymphoïde chronique (LLC). Dans le détail, les lysats de cellules leucémiques sont résolus par électrophorèse en 2 dimensions (2DE) et visualisées sous forme de "taches" sur les gels de 2DE. Analyse comparative des cartes protéomiques permet l'identification de protéines exprimées de façon différentielle (en termes d'abondance et de modifications post-traductionnelles) qui sont cueillies, isolé et identifié par spectrométrie de masse (MS). La fonction biologique des candidats identifiés peut être testée par des dosages différents (c.-à-migration, l'adhésion et la polymérisation de l'actine F), que nous avons optimisé pour les cellules leucémiques primaires.
Introduction
La leucémie lymphoïde chronique (LLC), la leucémie de l'adulte le plus fréquent dans les pays occidentaux, découle de l'accumulation de CD5 + lymphocytes B néoplasiques monoclonaux et est cliniquement très hétérogène. Il peut être présent sous une forme pré-leucémique, définie comme une lymphocytose monoclonal cellules B (MBL) 1,2,3. Dans d'autres cas, la maladie peut apparaître soit avec une évolutivité clinique, qui peut rester stable pendant des années avant d'avoir besoin de traitement, ou comme une maladie progressive avec chemorefractory mauvais pronostic malgré le traitement. Enfin, elle peut évoluer en un lymphome de haut grade fréquemment mortelle (syndrome RS de Richter) 2,3,4. Les patients sont généralement classés en deux sous-ensembles principaux: bon et mauvais pronostic, basé sur un ensemble de facteurs pronostiques qui fournit des informations complémentaires sur les prédicteurs de l'issue de la maladie et de la survie. L'hétérogénéité clinique reflète probablement l'hétérogénéité biologique. Un certain nombre de facteurs génétiques, microenvironnement et CEIl a été démontré facteurs llular de concourir à la pathogenèse de la maladie mais pas de mécanismes fédérateurs ont été trouvés 5. Dans le détail, plusieurs études ont démontré que les différences dans l'évolution clinique de la maladie peuvent s'expliquer en partie par la présence (ou l'absence) de certains marqueurs biologiques qui ont une valeur pronostique de 6,7,8. Ces données ont démontré qu'une meilleure compréhension de la biologie de la maladie pourrait fournir des indices supplémentaires pour la prise en charge clinique de la pathologie, par l'identification de deux marqueurs pronostiques et cibles thérapeutiques.
L'objectif du présent document est de montrer comment une combinaison de différentes techniques de protéomique peut être utilisé pour l'identification de protéines impliquées dans la LLC apparition et la progression. Notre approche démontre qu'il est possible de rejoindre protéomique ensemble de base et les données cliniques 5.
Dans le présent flux de travail, les cellules leucémiques primaires chez certains patients(Bon vs mauvais pronostic) sont isolés et les lysats cellulaires sont ensuite utilisés pour obtenir des cartes protéomiques. 2DE permet la caractérisation du profil protéomique d'une population de cellules, y compris des modifications post-traductionnelles, donnant ainsi des informations indirectes sur l'activité biologique de chaque protéine. Des lysats de cellules entières sont réglées par un premier passage de dimension sur la base du point isoélectrique, suivie d'une seconde dimension sur un gel de polyacrylamide qui permet de résoudre les protéines en fonction de leur poids moléculaire. Analyse comparative des cartes protéomiques permet l'identification de protéines différentiellement exprimés (à la fois en termes d'abondance et de modifications post-traductionnelles) comme des taches sur le gel qui peuvent être coupés et analysés par spectrométrie de masse. Le rôle de chaque candidat peut alors être exploité par différents tests.
Cette approche, limitée à CLL dans le manuscrit actuel, peut être facilement étendue à d'autres maladies / échantillons, fournissant ainsi des informations sur la proteomic / les différences biologiques entre les deux groupes (c.-à-pathologiques vs normale, stimulés vs, de type sauvage non stimulées vs knockdown).
Protocol
Representative Results
Discussion
Le but de ce manuscrit est de décrire un protocole optimisé pour l'identification de molécules impliquées dans la pathogenèse de la CLL, même si cette approche peut être étendue à d'autres maladies et / ou d'autres types d'échantillons de 16 à 18. En comparant les profils protéomiques de 2 sous-ensembles de patients atteints de LLC, de bons vs mauvais pronostic 19, nous avons démontré que ils diffèrent dans l'état de phosphorylation de HS1 et que s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions l'Unité des affections malignes lymphoïdes, Elisa dix Hacken, Lydia Scarfo, Massimo Alessio, Antonio Conti, Angela Bachi, et Angela Cattaneo.
Ce projet a été soutenu par: Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro AIRC (Investigator Grant et moléculaire Programme spécial Clinical Oncology – 5 pour mille # 9965)
CS et BA conçus l'étude, les expériences réalisées, ont analysé les données et rédigé le manuscrit. MTSB, UR, FBPR aidé à la rédaction du manuscrit. PG et FCC conçus les échantillons de l'étude ont fourni des patients et des données cliniques.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Acetonitril | MERCK | 61830025001730 | |
| Ammonium Bicarbonate | SIGMA | A6141-500G | |
| 1,4-Dithioerythritol | SIGMA | D9680-5G | |
| Iodoacetamide | SIGMA | I6125-25G | |
| Calcium chloride dihydrate | SIGMA | 223506-25G | |
| Trypsin, Sequencing Grade | ROCHE | 11418475001 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | SIGMA | C2020-10G | |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA | T6580 | |
| ZipTipµ-C18 | MILLIPORE | ZTC18M096 | |
| RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL | 15064 | |
| PBS | EUROCLONE | ECB4004L | |
| FBS | DOMINIQUE DUTSCHER | S1810 | |
| Lymphoprep | SENTINEL DIAGNOSTICS | 1114547 | |
| Trypan Blue | SIGMA | T8154 | |
| CD19 | BECKMAN COULTER | 082A07770 | ECD |
| CD5 | BECKMAN COULTER | 082A07754 | PC5 |
| CD3 | BECKMAN COULTER | 082A07746 | FITC |
| CD14 | BD | 345785 | PE |
| CD16 | BECKMAN COULTER | 082A07767 | PC5 |
| CD56 | BECKMAN COULTER | 082A07789 | PC5 |
| Ettan IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit | GE-Healthcare | 11-0033-64 | |
| Urea | SIGMA | U6504 | |
| Tris-Hcl Buffer | BIO-RAD | 161-0799 | |
| CHAPS | SIGMA | C2020-10G | |
| DTT | SIGMA | D9163-5G | |
| IPGstrips | GE-Healthcare | 17-1233-01 | Linear pH 4-7 18cm |
| IPGbuffer | GE-Healthcare | 17-6000-86 | pH 4-7 |
| Glycerol | SIGMA | G6279 | |
| PROTEAN II XL Cell | BIO-RAD | 165-3188 | |
| SDS | INVITROGEN | NP0001 | |
| Acrilamide | BIO-RAD | 161-0156 | |
| Agarosio | INVITROGEN | 16500 | |
| Methanol | SIGMA | 32213 | |
| Acetic Acid | VWR | 631000 | |
| Formalin | BIO-OPTICAL | 05-K01009 | |
| Ethanol | VWR | 9832500 | |
| Sodium Thiosulfate | FLUKA | 72049 | |
| Silver Nitrate | FLUKA | 85228 | |
| Molecular Dynamics Personal SI Laser Densitometer | Amersham Biosciences | ||
| ImageMaster 2D Platinum 5.0 | Amersham Biosciences | ||
| Sodium Carbonate | MERCK | A0250292 | |
| MALDI-TOF Voyager-DE STR | Applied Biosystems | ||
| Data Explorer software (version 3.2) | Applied Biosystems | ||
| transwell chambre 6.6 mm diameter | CORNING | 3421 | |
| RPMI | EUROCLONE | ECB2000L | WITH L-GLUTAMINE |
| Gentamicin | SIGMA | G1397 | |
| SDF-1 | PREPROTECH | 300-28A | |
| Flat-bottom 96-well plate | BECTON DICKINSON | 353072 | |
| BSA | SANTA CRUZ | 9048-46-8 | |
| ICAM-1 | R&D Systems | 720-IC | |
| CMFDA | Life Thechnology | C7025 | Green |
| IgM | SOUTHERNBIOTECH | 2020-02 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA | P6148 | |
| Saponine | SIGMA | S-7900 | |
| Phalloidin | Life Thechnology | A12379 | Alexa fluor 488 |
Riferimenti
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