从2DE凝胶点在蛋白质功能：在课慢性淋巴细胞白血病学到HS1
Summary
在这里，我们描述了一种协议，它把两个蛋白质组学技术，即2维电泳（2DE）和质谱（MS）来识别差异表达/翻译后修饰的蛋白质中的两个或多个基团主样品。这种做法，再加上功能性实验，允许预后标志物/治疗靶点的鉴定和表征。
Abstract
参与肿瘤发生和发展的分子的鉴定是基本的理解疾病的生物学和，其结果是，对于患者的临床管理。在目前的工作中，我们将介绍对参与慢性淋巴细胞白血病（CLL）的进展分子识别的优化蛋白质组学的方法。具体而言，白血病细胞裂解液是由二维电泳（2DE）解决，如可视化的双向凝胶电泳凝胶“点”。蛋白质组图谱进行比较分析允许差异表达的蛋白质的鉴定（在数量和翻译后修饰而言），该被拾取，分离并鉴定的质谱（MS）。所识别的候选者的生物学功能可以通过不同的测定（ 即迁移，粘附和F-肌动蛋白聚合）进行测试，我们已经对原代白血病细胞中进行优化。
Introduction
慢性淋巴细胞白血病（CLL），在西方国家中最常见的成人白血病，来源于单克隆肿瘤CD5 + B淋巴细胞的积累和在临床上是非常不均匀的。它可以作为一个预白血病形式，定义为单克隆B细胞淋巴细胞增多（MBL）1,2,3。在其他情况下这种疾病可以出现任何与懒惰的临床过程，可以无需治疗前数年保持稳定，或作为一个渐进的chemorefractory疾病，预后极差，尽管治疗。最后，它可能会发展成一种经常致命的高恶性度淋巴瘤（里氏综合征-RS）2,3,4。患者通常被分为两个主要亚群：好的和坏的预后，根据一组预后因素，提供对疾病预后和生存预测因素的补充信息。临床异质性可能反映了生物异质性。许多基因，微环境和CEllular因素已被证明同意对疾病发病机理虽然没有统一的机制，已发现5。详细地说，一些研究已经表明，在疾病的临床过程的差别可以通过的具有预后价值6,7,8某些生物标记物的存在（或不存在）被部分地说明。这些数据表明，更好的了解该疾病的生物学可用于病理学的临床管理提供额外的提示，由两个预后标志物和治疗靶的鉴定。
本研究的目的是为了表明如何不同的蛋白质组技术的组合可用于参与CLL发作和进展的蛋白质的鉴定。我们的做法表明，它有可能联合起来基本蛋白质组学和临床资料5。
在本工作流程中，主从选择的患者的白血病细胞（良好与不良的预后）被分离和细胞裂解物，然后用于获得蛋白质的地图。 2DE允许的细胞群体，包括翻译后修饰的蛋白质分布图的特性，从而使每个蛋白的生物学活性的间接信息。全细胞裂解物通过基于等电点的第一维运行，随即通过上是基于其分子量解析蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶上运行的第二尺寸。蛋白质组图谱进行比较分析允许差异表达的蛋白质的识别（无论是在数量和翻译后修饰而言）作为凝胶上的斑点可被切割并通过质谱法进行分析。每名候选人的角色可以由不同的试验来再利用。
这种方法中，只限于CLL在当前的手稿，可以很容易地扩展到其他疾病/样品，从而提供关于proteomi信息C /两组之间的生物学差异（ 即病理性与正常，刺激比未受刺激，野生型与击倒）。
Protocol
Representative Results
Discussion
该原稿的目的在于描述一个优化的协议中涉及白血病的发病机制中的分子的识别，即使这种方法可以扩展到其它的疾病和/或其他类型的样品16-18。通过比较2亚CLL患者，良好与不良预后19的蛋白质组曲线，我们表明，它们在HS1的磷酸化状态的不同，它的激活影响白血病细胞的迁移和粘附能力。
相对于其他方法，在手稿，2DE凝胶和MS给出的蛋白质组技?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢淋巴组织的恶性肿瘤单位，Elisa的10克勤，肥姐Scarfò，马西莫·阿莱西奥，安东尼奥·孔蒂，安吉拉八尺，和Angela郭居静。
该项目支持：ASSOCIAZIONE ITALIANA每拉Ricerca SUL巨蟹座AIRC（调查员补助金和特别节目分子肿瘤学 – 5千分数＃9965）
CS和BA设计的研究，进行了实验，分析数据和撰写文章。 MTSB，UR，FBPR协助撰写稿件。 PG和FCC的设计提供了研究患者的标本和临床资料。
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Acetonitril | MERCK | 61830025001730 | |
| Ammonium Bicarbonate | SIGMA | A6141-500G | |
| 1,4-Dithioerythritol | SIGMA | D9680-5G | |
| Iodoacetamide | SIGMA | I6125-25G | |
| Calcium chloride dihydrate | SIGMA | 223506-25G | |
| Trypsin, Sequencing Grade | ROCHE | 11418475001 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | SIGMA | C2020-10G | |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA | T6580 | |
| ZipTipµ-C18 | MILLIPORE | ZTC18M096 | |
| RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL | 15064 | |
| PBS | EUROCLONE | ECB4004L | |
| FBS | DOMINIQUE DUTSCHER | S1810 | |
| Lymphoprep | SENTINEL DIAGNOSTICS | 1114547 | |
| Trypan Blue | SIGMA | T8154 | |
| CD19 | BECKMAN COULTER | 082A07770 | ECD |
| CD5 | BECKMAN COULTER | 082A07754 | PC5 |
| CD3 | BECKMAN COULTER | 082A07746 | FITC |
| CD14 | BD | 345785 | PE |
| CD16 | BECKMAN COULTER | 082A07767 | PC5 |
| CD56 | BECKMAN COULTER | 082A07789 | PC5 |
| Ettan IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit | GE-Healthcare | 11-0033-64 | |
| Urea | SIGMA | U6504 | |
| Tris-Hcl Buffer | BIO-RAD | 161-0799 | |
| CHAPS | SIGMA | C2020-10G | |
| DTT | SIGMA | D9163-5G | |
| IPGstrips | GE-Healthcare | 17-1233-01 | Linear pH 4-7 18cm |
| IPGbuffer | GE-Healthcare | 17-6000-86 | pH 4-7 |
| Glycerol | SIGMA | G6279 | |
| PROTEAN II XL Cell | BIO-RAD | 165-3188 | |
| SDS | INVITROGEN | NP0001 | |
| Acrilamide | BIO-RAD | 161-0156 | |
| Agarosio | INVITROGEN | 16500 | |
| Methanol | SIGMA | 32213 | |
| Acetic Acid | VWR | 631000 | |
| Formalin | BIO-OPTICAL | 05-K01009 | |
| Ethanol | VWR | 9832500 | |
| Sodium Thiosulfate | FLUKA | 72049 | |
| Silver Nitrate | FLUKA | 85228 | |
| Molecular Dynamics Personal SI Laser Densitometer | Amersham Biosciences | ||
| ImageMaster 2D Platinum 5.0 | Amersham Biosciences | ||
| Sodium Carbonate | MERCK | A0250292 | |
| MALDI-TOF Voyager-DE STR | Applied Biosystems | ||
| Data Explorer software (version 3.2) | Applied Biosystems | ||
| transwell chambre 6.6 mm diameter | CORNING | 3421 | |
| RPMI | EUROCLONE | ECB2000L | WITH L-GLUTAMINE |
| Gentamicin | SIGMA | G1397 | |
| SDF-1 | PREPROTECH | 300-28A | |
| Flat-bottom 96-well plate | BECTON DICKINSON | 353072 | |
| BSA | SANTA CRUZ | 9048-46-8 | |
| ICAM-1 | R&D Systems | 720-IC | |
| CMFDA | Life Thechnology | C7025 | Green |
| IgM | SOUTHERNBIOTECH | 2020-02 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA | P6148 | |
| Saponine | SIGMA | S-7900 | |
| Phalloidin | Life Thechnology | A12379 | Alexa fluor 488 |
Riferimenti
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