Qui si descrive un protocollo che le coppie due tecniche di proteomica, cioè 2-dimensionale elettroforesi (2DE) e spettrometria di massa (MS), per identificare differenzialmente espressi / proteine modificate post-traduzionali tra due o più gruppi di campioni elementari. Questo approccio, insieme a esperimenti funzionali, permette l'identificazione e la caratterizzazione di marcatori prognostici / bersagli terapeutici.
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Articolo metodologico
Da un 2DE-Gel Spot Proteine Funzione: Lesson Learned From HS1 nella leucemia linfocitica cronica
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'identificazione di molecole coinvolte nell'iniziazione e progressione tumorale è fondamentale per la biologia comprensione della malattia e, di conseguenza, per la gestione clinica dei pazienti. Nel presente lavoro descriviamo un approccio proteomico ottimizzato per l'identificazione di molecole coinvolte nella progressione della leucemia linfocitica cronica (CLL). Nel dettaglio, lisati di cellule leucemiche sono risolte da 2-dimensionale elettroforesi (2DE) e visualizzate come "macchie" sui gel 2DE. Analisi comparativa delle mappe proteomiche permette l'identificazione delle proteine differenzialmente espressi (in termini di abbondanza e modificazioni post-traduzionali) che vengono raccolti, isolato e identificato da spettrometria di massa (MS). La funzione biologica dei candidati individuati può essere controllata con diversi saggi (cioè la migrazione, adesione e polimerizzazione F-actina), che abbiamo ottimizzato per le cellule leucemiche primarie.
Introduzione
Leucemia linfocitica cronica (CLL), la leucemia dell'adulto più comune nei paesi occidentali, deriva dall'accumulo di monoclonali CD5 + linfociti B neoplastici ed è clinicamente molto eterogenea. Può essere presente come una forma di pre-leucemiche, definito come linfocitosi monoclonale delle cellule B (MBL) 1,2,3. In altri casi la malattia può apparire sia con un decorso clinico indolente, che può rimanere stabile per anni prima di avere bisogno del trattamento, o come una malattia chemorefractory progressiva con prognosi infausta nonostante la terapia. Infine, si può progredire in un linfoma di alto grado spesso letali (sindrome di Ric....
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Protocollo
NOTA: Tutti i campioni di tessuto sono stati ottenuti con l'approvazione del Comitato Etico dell'Ospedale San Raffaele (Milano, Italia).
1 campioni di tessuti umani e purificazione delle cellule (Figura 1)
NOTA: i linfociti leucemiche sono stati ottenuti da sangue periferico (PB) di pazienti affetti da LLC, diagnosticati secondo Mulligan et al 9.
1.1) La separazione delle cellule leucemiche da PB
- Raccogliere PB in provette di raccolta del sangue con vacutainer sodio eparina.
- Trasferire il sangue in una provetta da 15 ml e aggiungere B-cellula u....
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Risultati
Abbiamo isolato le cellule B leucemiche primarie formano PB di pazienti affetti da LLC e abbiamo analizzato le mappe proteomiche. I campioni (n = 104) sono stati raggruppati in due sottoinsiemi principali in base alle caratteristiche cliniche di ciascun paziente (cattiva prognosi vs buona prognosi) ed è stata eseguita l'analisi comparativa dei gel 2DE.
L'identificazione analisi ha permesso di spot differenzialmente espressi tra i due sottoinsiemi (in termini di presenza / assenza o .......
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Discussione
Lo scopo di questo manoscritto è di descrivere un protocollo ottimizzato per l'identificazione di molecole coinvolte nella patogenesi della LLC, anche se questo approccio può essere esteso ad altre malattie e / o altri tipi di campioni 16-18. Confrontando i profili proteomici di 2 sottogruppi di pazienti con LLC, buoni vs cattivi prognosi 19, abbiamo dimostrato che differiscono per lo stato di fosforilazione di HS1 e che la sua attivazione colpisce la migrazione e l'adesione .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Neoplasie Unità linfoide, Elisa dieci Hacken, Lydia Scarfò, Massimo Alessio, Antonio Conti, Angela Bachi, e Angela Cattaneo.
Questo progetto è stato sostenuto da: Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro AIRC (Investigator Grant e Programma Speciale di Oncologia Molecolare Clinica - 5 per mille 9965 #)
CS e BA progettato lo studio, eseguito gli esperimenti, hanno analizzato i dati e scritto il manoscritto. MTSB, UR, FBPR assistito nella scrittura del manoscritto. PG e FCC progettati campioni Lo studio ha fornito dei pazienti e dati clinici.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acetonitril | MERCK | 61830025001730 | |
| Bicarbonato di ammonio | SIGMA | A6141-500G | |
| 1,4-ditioeritritolo | SIGMA | D9680-5G | |
| Iodoacetamide | SIGMA | I6125-25G | |
| Cloruro di calcio diidrato | SIGMA | 223506-25G | |
| Tripsina, grado di sequenziamento | ROCHE | 11418475001 | |
| α- acido ciano-4-idrossicinnamico | SIGMA | C2020-10G | |
| Acido trifluoroacetico | SIGMA | T6580 | |
| ZipTipµ-C18 | MILLIPORE | ZTC18M096 | |
| RosettaSep Cocktail di arricchimento di cellule B umane | STEMCELL | 15064 | |
| PBS | EUROCLONE | ECB4004L | |
| FBS | DOMINIQUE DUTSCHER | S1810 | |
| Lymphoprep | SENTINEL DIAGNOSTICS | 1114547 | |
| Trypan Blue | SIGMA | T8154 | |
| CD19 | BECKMAN COULTER | 082A07770 | ECD |
| CD5 | BECKMAN COULTER | 082A07754 | PC5 |
| CD3 | BECKMAN COULTER | 082A07746 | FITC |
| CD14 | BD | 345785 | PE |
| CD16 | BECKMAN COULTER | 082A07767 | PC5 |
| CD56 | BECKMAN COULTER | 082A07789 | PC5 |
| Ettan IPGphor 3 Unità di messa a fuoco isoelettrica | GE-Healthcare | 11-0033-64 | |
| Urea | SIGMA | U6504 | |
| Tris-HCL Tampone | BIO-RAD | 161-0799 | |
| CHAPS | SIGMA | C2020-10G | |
| DTT | SIGMA | D9163-5G | |
| IPGstrips | GE-Healthcare | 17-1233-01 | pH lineare 4-7 18cm |
| IPGbuffer | GE-Healthcare | 17-6000-86 | pH 4-7 |
| Glicerolo | SIGMA | G6279 | |
| PROTEAN II XL Cell | BIO-RAD | 165-3188 | |
| SDS | INVITROGEN | NP0001 | |
| Acrilammide | BIO-RAD | 161-0156 | |
| Agarosio | INVITROGEN | 16500 | |
| Metanolo | SIGMA | 32213 | |
| Acido acetico | VWR | 631000 | |
| Formalina | BIO-OPTICAL | 05-K01009 | |
| Etanolo | VWR | 9832500 | |
| Tiosolfato di sodio | FLUKA | 72049 | |
| Nitrato d'argento | FLUKA | 85228 | |
| Dinamica molecolare Densitometro laser SI personale | Amersham Biosciences | ||
| ImageMaster 2D Platinum 5.0 | Amersham Biosciences | ||
| Carbonato di sodio | MERCK | A0250292 | |
| MALDI-TOF Voyager-DE STR | Applied Biosystems | ||
| Data Explorer software (versione 3.2) | Applied Biosystems | ||
| camera transwell diametro 6,6 mm | CORNING | 3421 | |
| RPMI | EUROCLONE | ECB2000L | CON L-GLUTAMMINA |
| Gentamicina | SIGMA | G1397 | |
| SDF-1 | PREPROTECH | 300-28A | |
| Piastra a fondo piatto a 96 pozzetti | BECTON DICKINSON | 353072 | |
| BSA | SANTA CRUZ | 9048-46-8 | |
| ICAM-1 | R& D Systems | 720-IC | |
| CMFDA | Life Thechnology | C7025 | IgM verde |
| SOUTHERNBIOTECH | 2020-02 | ||
| Paraformaldeide | SIGMA | P6148 | |
| Saponina | SIGMA | S-7900 | |
| Falloidina | Vita Tecnologia | A12379 | Alexa fluor 488 |
Riferimenti
- Caligaris-Cappio, F., Ghia, P. Novel insights in chronic lymphocytic leukemia: are we getting closer to understanding the pathogenesis of the disease. J Clin Oncol. 26, 4497-4503 (2008).
- Rawstron, A. C., et al. Monoclonal B-....
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Ristampe e permessi
