Hier beschreiben wir ein Protokoll, das zwei Paare Proteom-Techniken, nämlich 2-dimensionale Elektrophorese (2DE) und Massenspektrometrie (MS), differentiell zwischen zwei oder mehr Gruppen von Primärproben ausgedrückt identifizieren / post-translationale modifizierten Proteinen. Dieser Ansatz, der zusammen mit funktionellen Experimenten ermöglicht die Identifizierung und Charakterisierung von Prognosemarkern / therapeutische Ziele.
Die Identifizierung von Molekülen in der Tumorprogression beteiligt Initiierung und ist von grundlegender Bedeutung für das Verständnis der Biologie und Erkrankung als Folge, für die klinische Behandlung von Patienten. In der vorliegenden Arbeit werden wir eine optimierte proteomischen Ansatz für die Identifizierung von Molekülen in der Progression der chronischen lymphatischen Leukämie (CLL) beteiligt zu beschreiben. Im Einzelnen werden leukämischen Zell-Lysaten durch 2-dimensionale Elektrophorese (2DE) gelöst und als "Flecken" auf der 2DE Gelen visualisiert. Vergleichende Analyse von Proteom-Karten ermöglicht die Identifizierung von differentiell exprimierten Proteine (in Bezug auf die Fülle und post-translationale Modifikationen), die abgeholt werden, isoliert und identifiziert durch Massenspektrometrie (MS). Die biologische Funktion der identifizierten Kandidaten kann durch verschiedene Assays (dh Migration, Adhäsion und F-Aktin-Polymerisation) getestet werden, dass man für die primäre Leukämiezellen optimiert wurden.
Chronische lymphatische Leukämie (CLL), der häufigsten Leukämie bei Erwachsenen in den westlichen Ländern, ergibt sich aus der Akkumulation von monoklonalen Tumor CD5 + B-Lymphozyten und ist klinisch sehr heterogen. Es kann als ein Pre-Leukämieform, die als monoklonale B-Zell-Lymphozytose (MBL) 1,2,3 vorliegen. In anderen Fällen kann die Krankheit erscheinen entweder mit einem indolenten klinischen Verlauf, dass über Jahre stabil bleiben, bevor eine Behandlung benötigen kann, oder als progressive Erkrankung mit chemorefractory düstere Prognose trotz Therapie. Schließlich kann es in eine tödliche häufig hochgradige Lymphom (Richter-Syndrom-RS) 2,3,4 Fortschritt. Gute und schlechte Prognose, basierend auf einer Reihe von prognostischen Faktoren, die ergänzende Informationen zu Prädiktoren der Krankheitsverlauf und die Überlebens bietet: Die Patienten werden in der Regel in zwei Hauptuntergruppen klassifiziert. Klinische Heterogenität spiegelt wahrscheinlich biologische Heterogenität. Eine Reihe von genetischen, Mikroumgebung und CEllular Faktoren wurde gezeigt, dass auf Pathogenese stimmen aber keine einheitliche Mechanismen wurden 5. Im Einzelnen haben mehrere Studien gezeigt, dass Unterschiede in den klinischen Verlauf der Krankheit kann teilweise durch das Vorhandensein (oder die Abwesenheit) von einigen biologischen Markern, die einen prognostischen Wert haben 6,7,8 erläutert. Diese Daten zeigten, dass ein besseres Verständnis der Krankheit Biologie könnte zusätzliche Hinweise für die klinische Behandlung der Pathologie liefern, durch die Identifizierung von sowohl prognostische Marker und therapeutischer Targets.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, zu zeigen, wie eine Kombination von verschiedenen proteomischen Techniken für die Identifizierung von Proteinen in CLL Entstehung und Progression beteiligt sind, verwendet werden. Unser Ansatz zeigt, dass es möglich ist, gemeinsam Grund Proteom-und klinischen Daten 5 verbinden.
In der vorliegenden Workflow, primäre Leukämiezellen von Patienten ausgewählt(Gut vs schlechte Prognose) werden isoliert und Zelllysaten werden dann verwendet, um Proteom-Karten zu erhalten. 2DE erlaubt die Charakterisierung der proteomischen Profil einer Zellpopulation, einschließlich post-translationale Modifikationen, wodurch indirekt Informationen über die biologische Aktivität des jeweiligen Proteins. Ganzzell-Lysate werden durch eine erste Dimension laufen, bezogen auf den isoelektrischen Punkt gelöst, gefolgt von einer zweiten Dimension auf einem Polyacrylamid-Gel, das Proteine löst auf der Grundlage ihres Molekulargewichts führen. Vergleichende Analyse der Proteom-Karten ermöglicht die Identifizierung der differenziell exprimierten Proteine (sowohl in Bezug auf Menge und posttranslationale Modifikationen) als Punkte auf dem Gel ausgeschnitten und durch Massenspektrometrie analysiert werden können. Die Rolle der einzelnen Kandidaten kann dann durch verschiedene Tests genutzt werden.
Dieser Ansatz, der CLL in der aktuellen Manuskript beschränkt, kann leicht auf andere Krankheiten / Proben erweitert werden, damit die Bereitstellung von Informationen über die proteomic / biologischen Unterschiede zwischen beiden Gruppen (dh pathologische vs normal, nicht stimulierten vs Wildtyp vs Zuschlags stimuliert).
Das Ziel dieses Manuskript ist, um ein optimiertes Protokoll für die Identifizierung von Molekülen in der Pathogenese der CLL beteiligt zu beschreiben, auch wenn dieser Ansatz auf andere Krankheiten und / oder anderen Probentypen 16-18 verlängert werden. Durch Vergleich der proteomischen Profile 2 Untergruppen von CLL-Patienten gut gegen schlechte Prognose 19 zeigten wir, dass sie sich in der Phosphorylierung von HS1 und dessen Aktivierung das Wandern und Haftfähigkeit von Leukä…
The authors have nothing to disclose.
Wir danken dem malignen Lymphomen Einheit, Elisa ten Hacken, Lydia Scarfò, Massimo Alessio, Antonio Conti, Angela Bachi, und Angela Cattaneo.
Dieses Projekt wurde unterstützt von: Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro AIRC (Investigator Grant und Special Program Molecular Clinical Oncology – 5 Promille # 9965)
CS und BA entwarf die Studie durchgeführt, die Versuche, die Daten analysiert und schrieb das Manuskript. MTSB, UR, FBPR des Manuskriptes unterstützt. PG und FCC entwickelt die Studie vorgesehenen Patientenproben und klinischen Daten.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Acetonitril | MERCK | 61830025001730 | |
Ammonium Bicarbonate | SIGMA | A6141-500G | |
1,4-Dithioerythritol | SIGMA | D9680-5G | |
Iodoacetamide | SIGMA | I6125-25G | |
Calcium chloride dihydrate | SIGMA | 223506-25G | |
Trypsin, Sequencing Grade | ROCHE | 11418475001 | |
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | SIGMA | C2020-10G | |
Trifluoroacetic acid | SIGMA | T6580 | |
ZipTipµ-C18 | MILLIPORE | ZTC18M096 | |
RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL | 15064 | |
PBS | EUROCLONE | ECB4004L | |
FBS | DOMINIQUE DUTSCHER | S1810 | |
Lymphoprep | SENTINEL DIAGNOSTICS | 1114547 | |
Trypan Blue | SIGMA | T8154 | |
CD19 | BECKMAN COULTER | 082A07770 | ECD |
CD5 | BECKMAN COULTER | 082A07754 | PC5 |
CD3 | BECKMAN COULTER | 082A07746 | FITC |
CD14 | BD | 345785 | PE |
CD16 | BECKMAN COULTER | 082A07767 | PC5 |
CD56 | BECKMAN COULTER | 082A07789 | PC5 |
Ettan IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit | GE-Healthcare | 11-0033-64 | |
Urea | SIGMA | U6504 | |
Tris-Hcl Buffer | BIO-RAD | 161-0799 | |
CHAPS | SIGMA | C2020-10G | |
DTT | SIGMA | D9163-5G | |
IPGstrips | GE-Healthcare | 17-1233-01 | Linear pH 4-7 18cm |
IPGbuffer | GE-Healthcare | 17-6000-86 | pH 4-7 |
Glycerol | SIGMA | G6279 | |
PROTEAN II XL Cell | BIO-RAD | 165-3188 | |
SDS | INVITROGEN | NP0001 | |
Acrilamide | BIO-RAD | 161-0156 | |
Agarosio | INVITROGEN | 16500 | |
Methanol | SIGMA | 32213 | |
Acetic Acid | VWR | 631000 | |
Formalin | BIO-OPTICAL | 05-K01009 | |
Ethanol | VWR | 9832500 | |
Sodium Thiosulfate | FLUKA | 72049 | |
Silver Nitrate | FLUKA | 85228 | |
Molecular Dynamics Personal SI Laser Densitometer | Amersham Biosciences | ||
ImageMaster 2D Platinum 5.0 | Amersham Biosciences | ||
Sodium Carbonate | MERCK | A0250292 | |
MALDI-TOF Voyager-DE STR | Applied Biosystems | ||
Data Explorer software (version 3.2) | Applied Biosystems | ||
transwell chambre 6.6 mm diameter | CORNING | 3421 | |
RPMI | EUROCLONE | ECB2000L | WITH L-GLUTAMINE |
Gentamicin | SIGMA | G1397 | |
SDF-1 | PREPROTECH | 300-28A | |
Flat-bottom 96-well plate | BECTON DICKINSON | 353072 | |
BSA | SANTA CRUZ | 9048-46-8 | |
ICAM-1 | R&D Systems | 720-IC | |
CMFDA | Life Thechnology | C7025 | Green |
IgM | SOUTHERNBIOTECH | 2020-02 | |
Paraformaldehyde | SIGMA | P6148 | |
Saponine | SIGMA | S-7900 | |
Phalloidin | Life Thechnology | A12379 | Alexa fluor 488 |