La synthèse in vitro de l'ARNm modifié pour l'induction de l'expression des protéines dans les cellules humaines

Summary

Dans cet article, vidéo, on décrit la synthèse in vitro de l'ARNm modifié pour l'induction de l'expression des protéines dans les cellules.

Abstract

La fourniture exogène d'un ARN messager codant synthétique (ARNm) pour l'induction de la synthèse des protéines dans les cellules souhaitées a un potentiel énorme dans les domaines de la médecine régénérative, la biologie de la cellule de base, le traitement de maladies, et la reprogrammation de cellules. Ici, nous décrivons une étape par étape de protocole pour la production de l'ARNm modifié avec un potentiel d'activation immunitaire réduite et une meilleure stabilité, le contrôle de la qualité de l'ARNm produit, la transfection de cellules avec de l'ARNm et de la vérification de l'expression de la protéine induite par cytométrie en flux. Jusqu'à 3 jours après une seule transfection avec eGFP ARNm, les cellules HEK 293 transfectées produisent eGFP. Dans cet article, la vidéo, la synthèse de l'ARNm eGFP est décrite à titre d'exemple. Cependant, la procédure peut être appliquée à la production de l'ARNm d'autres souhaités. Utilisation de la synthèse de l'ARNm modifié, les cellules peuvent être amenés à exprimer transitoirement les protéines désirées, dont ils ne seraient normalement pas exprimer.

Introduction

Dans les cellules, la transcription de l'ARN messager (ARNm) et la traduction de l'ARNm en suivant protéines désirées assurer le bon fonctionnement des cellules. Troubles génétiques héréditaires ou acquis peuvent conduire à la synthèse insuffisante et dysfonctionnel de protéines et provoquer des maladies graves. Ainsi, une nouvelle approche thérapeutique pour induire la production de protéines manquantes ou défectueuses est exogène de la livraison synthétique modifié ARNm dans des cellules, qui code pour la protéine désirée. Ainsi, les cellules sont déclenchées à synthétiser des protéines fonctionnelles, dont ils ne peuvent normalement pas produire ou seraient naturellement pas besoin. En utilisant cette approche, des troubles génétiques peuvent être corrigés par introduction de l'ARNm qui code pour la protéine défectueuse ou manquante ^1. Le traitement de l'ARNm peut également être utilisé pour la vaccination de synthétiser des antigènes protéiques qui sont exprimés par les cellules tumorales ou de pathogènes. De ce fait, le système immunitaire de l'hôte peut être activé afin d'éliminer efficacement les cellules tumorales ou prévenir infections ^2,3. En outre, ces dernières années, l'ARNm a été utilisée avec succès pour générer des cellules souches pluripotentes induites (CISP). A cet effet, les fibroblastes ont été transfectées avec des ARNm pour induire l'expression de facteurs de reprogrammation ^4-6 et pour les convertir en iPSCs avec un énorme potentiel en médecine régénératrice.

Auparavant, l'utilisation de l'ARNm conventionnel a été associée à une faible stabilité et une forte immunogénicité. Ainsi, les applications cliniques des ARNm conventionnelles ont été limitées. Toutefois, le remplacement de la cytidine et l'uridine par la 5-méthylcytidine et pseudouridine intérieur de la molécule d'ARNm en Kariko et collègues rendu des molécules d'ARNm stables dans les fluides biologiques et de réduire considérablement l'activation immunitaire ^10.7, ce qui permet maintenant l'applicabilité clinique de l'ARNm modifiés.

Utilisation ARNm modifiés produits par synthèse, les transcriptions de gènes souhaités peuvent être livrés temporairement in vivo ¹¹ou in vitro pour induire l'expression de la protéine. L'ARNm est traduit introduit dans des conditions physiologiques par la machinerie de traduction cellulaire. En raison de l'absence d'intégration dans le génome de la cellule hôte par rapport à des vecteurs viraux pour la thérapie génique, le risque d'oncogenèse est empêché ^12,13. Ainsi, la thérapie utilisant de l'ARNm synthétique modifié ira mieux acceptation clinique à l'avenir.

Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour la production de l'ARNm modifié (figure 1), la transfection de cellules avec l'ARNm et de l'évaluation de l'expression des protéines dans les cellules transfectées.

Protocol

1. Augmentation de plasmides contenant nécessité de classer les séquences d'ADN (CDS) Préchauffer milieu SOC, qui est inclus dans le kit de transformation, à la température ambiante et les plaques de gélose LB contenant 100 ug / ml d'ampicilline à 37 ° C. Équilibrer le bain d'eau à 42 ° C. Décongelez un flacon de composant chimique E. coli sur la glace. Ajouter 1-5 ul du plasmide (10 pg à 100 ng) contenant les CDS dans le flacon de composant chimique …

Representative Results

Utilisation d'un plasmide pcDNA 3.3 contenant les CDS de la EGFP, la synthèse de l'ARNm modifié eGFP a été établie (figure 1). Après insert amplification par PCR et poly T-tailing, une bande claire avec une longueur d'environ 1100 pb est détecté (Figure 2). L'augmentation du temps de IVT augmenté le rendement de l'ARNm (Figure 3). Après l'IVT, une bande d'ARNm clair avec une longueur d'environ 1100 pb a été détecté, ce qui c…

Discussion

La thérapie ARNm a un énorme potentiel dans le domaine de la médecine régénérative, le traitement des maladies et la vaccination. Dans cette vidéo, nous démontrons la production d'un ARNm modifié stabilisée pour l'induction de l'expression des protéines dans les cellules. En utilisant ce protocole, d'autres ARNm souhaités peuvent être générés. La synthèse in vitro de l'ARNm modifié permet la transfection de cellules avec des ARNm désirées pour induire l'expression de …

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Cell culture
DMEM, high glucose	PAA	E15-009
FBS	Life Technologies	10500
Penicillin/Streptomycin	PAA	P11-010	100x
L-glutamine	PAA	M11-004	200 mM
DPBS without calcium and magnesium	PAA	E15-002
0.04% Trypsin / 0.03% EDTA	Promocell	C-41020
TNS	Promocell	C-41120	Trypsin Neutralizing Solution, 0.05% trypsin inhibitor in 0.1% BSA
HEK-293 cells	ATCC	CRL-1573
Consumables
Tissue culture plates, 12-well	Corning	3512
Cell culture flask (75 cm2)	Corning	430641
DNase-and RNase-free 1.5 ml sterile microcentrifuge tubes	Eppendorf	0030 121.589	Safe-Lock, Biopur
15 ml conical tubes	greiner bio-one	188271
PCR clean and sterile epT.I.P.S. dualfilter pipette tips	Eppendorf	10 µl: 022491202,    100 µl: 022491237, 1000 µl: 022491253
Cryovial	greiner bio-one	122279-128	Cryo.s
14 ml polypropylene round bottom tube for bacterial culture	BD Falcon	352059
Plasmid amplification and purification
pcDNA 3.3_eGFP Plasmid	Addgene	26822
One Shot Top10 chemically component Escherichia coli	Invitrogen	C4040-10
Sterile water (Ampuwa)	Fresenius Kabi	1636071
LB medium (Luria/Miller)	Carl Roth	X968.1	Dissolve 25 g l-1 in sterile water.
LB agar (Luria/Miller)	Carl Roth	X969.1	Dissolve 40 g l-1 in sterile water.
Ampicillin Ready Made Solution	Sigma Aldrich	A5354	100 mg/ml
Glycerol	Sigma Aldrich	G2025
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104
mRNA production
HotStar HiFidelity Polymerase Kit	Qiagen	202602
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28106
MEGAscript T7 Kit	Life Technologies	AM1334
5-Methylcytidine-5´-triphosphate	Trilink	N1014	5-Methyl-CTP
Pseudouridine-5´-triphosphate	Trilink	N1019	Pseudo-UTP
3´-O-Me-m7G(5´)ppp(5`)G RNA cap structure analog	New England Biolabs	S1411L
RiboLock RNase Inhibitor	Thermo Scientific	EO0381	40 U/µl
TURBO DNase	Life Technologies	AM1334	2 U/µl (from MEGAscript T7 Kit)
Antarctic phosphatase	New England Biolabs	MO289S
RNeasy mini kit	Qiagen	74104
RNaseZap solution	Life Technologies	AM9780
Transfection
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Invitrogen	11668-019	Cationic lipid transfection reagent
Opti-MEM I Reduced Serum Media	Invitrogen	11058-021	Improved Minimal Essential Medium (MEM) with  reduced Fetal Bovine Serum (FBS) supplementation
Gel electrophoresis
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Gelred Nucleic Acid Gel Stain	Biotium	41003	10,000x in water
peqGOLD Range Mix DNA-Ladder	Peqlab	25-2210
0.5-10 kb RNA Ladder	Invitrogen	15623-200
1x TBE buffer
Flow cytometry analyses
CellFIX (1x)	BD Biosciences	340181	10x concentrate
Primer for insert amplification and         poly (T) tail PCR
Forward Primer (HPLC-grade) 10 µM	Ella Biotech		5´-TTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACG-3´
Reverse Primer (HPLC-grade) 10 µM	Ella Biotech		5´- T120-CTTCCTACTCAGGCTTTATTCAAAGACCA-3´
Equipment
Cell incubator	Binder		CO2 (5%) and O2 (20%)
CASY cell counter	Schärfe System
Sterile workbench	BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH
Bacterial incubator	Incutec
Water bath
ScanDrop spectrophotometer	Analytic Jena
PCR thermocycler	Eppendorf
Microcentrifuge	Eppendorf
Vortex	peqlab
Thermomixer	Eppendorf
Gel apparatus for electrophoresis	Bio-Rad
Gel documentation system	Bio-Rad
FACScan System	BD Biosciences
Fluorescence microscope	Nikon
Phase-contrast microscope	Zeiss