의 전파<em> Homalodisca의 coagulata 바이러스-01</em>를 통해<em> Homalodisca vitripennis</em> 세포 배양
Summary
여기에서 우리는 시험 관내에서 Homalodisca vitripennis 세포와 HoCV-1을 전파하는 프로토콜을 제시한다. 중간 HoCV – 한 긍정적 인 문화에서 제거하고 RNA는 168 시간 동안 매 24 시간을 추출 하였다. 세포 생존은 트리 판 블루 염색에 의해 정량 하였다. 전체 바이러스 입자는 감염 후를 추출 하였다. 추출 된 RNA는 QRT-PCR에 의해 정량 하였다.
Abstract
유리 날개 사격의 명수 (Homalodisca vitripennis)은 미국 남서부에 걸쳐 발견 매우 vagile 및 잡식성 곤충이다. 이 곤충은 Xylella fastidiosa (X를 fastidiosa)의 주된 벡터, 포도 나무의 피어스 병 (PD)의 인과 에이전트 목부 제한 박테리아입니다. 피어스 병은 경제적 피해이고; 따라서 H. vitripennis 병원체 관리 전략의 대상이되고있다. Homalodisca의 coagulata 바이러스-01 (HoCV-01)로 확인 dicistrovirus는 H.의 사망률 증가와 관련이있다 vitripennis 인구. 숙주 세포는 01-HoCV 복제에 필요하기 때문에, 세포 배양 물은 생물 농약과 물류 생산 경제적 가치가 타겟팅 복제 일정한 환경을 제공한다. 이 연구, H. 대규모 전파 시스템 조직 배양을 통해 vitripennis 세포가 개발 한 P바이러스 복제 메커니즘을 roviding. HoCV-01는 몸 전체의 곤충에서 추출하여 배양 된 H. 접종에 사용 된 다양한 수준에서 vitripennis 세포. 배지는 168 시간, RNA 추출 QRT-PCR 분석을위한 매 24 시간을 제거 하였다. 세포는 트리 판 블루로 염색하고 광학 현미경을 이용하여 세포의 생존 성을 정량화하는 계수 하였다. 항목의 바이러스 입자는 전체 세포 배양 붕괴가 발생하기 전에 것으로 결정된 시점이었다 감염 후 96 시간, 최대 추출 하였다. 세포는 형광 염색을 실시하고 F-액틴 및 첨부 핵 무결성에 바이러스 활성을 조사하기 위해 공 초점 현미경을 사용하여 보여졌다. 이 연구의 결론은 있다는 것이다 H. vitripennis 세포 배양 생물 농약의 생산을 허용하기에 적합한 수준으로 HoCV-01의 대량 생산을 위해 사용 가능하다.
Introduction
유리 날개의 명사수 (Homalodisca vitripennis Germar 1821)는 북미 1, Xylella fastidiosa (X를 fastidiosa)의 지배적 인 벡터로 포도 나무 (PD)의 피어스 병의 인과 에이전트를 확인되었습니다. 곤충 인구 관리는 빨리 캘리포니아와 미국 남부에서 포도 재배 산업이 파괴 문제를 해결하기위한 연구의 초점이되었다. 가족에 속하는 양의 감지, 단일 가닥 RNA 바이러스는 Dicistroviridae, Homalodisca는 coagulata 바이러스-01 (HoCV-01) 야생 H.에서 발견되었습니다 vitripennis 인구와 살충제로 곤충의 저항을 낮추고, 그 인구 2-4에서 사망률이 증가하는 것으로.
방법의 개발을 효과적으로 후방 H. 감염합니다 실험실 환경에서 성년 vitripennis 때문에 어려웠을 <em> H. vitripennis는 기주 식물 5-8의 다양한 요구 다른 단계 별 영양 필요가있다. 특정 시설 후면 라이브 H.에 필요한 미국에서 vitripennis; 따라서, 세포 배양 물은 더 경제적이고 실용적인 대안뿐만 아니라 HoCV-01 검출 및 복제 2,9 점점 중요하다. H.의 세포 배양을위한 기본적인 방법 확립하면서 vitripennis는 바이러스 2로, 이러한 방법은 아직 생물학적 조절제의 상업 생산에 이용되지 않은, 설명되어 있습니다.
다음 절차의 전체적인 목적은 생물학적 방제 제로서 이용하기에 적합한 HoCV-0129의 높은 농도를 생성하는 것이다. 바이러스 성 복제는 왜 성공적으로 H. 육성 및 최적화 된 살아있는 세포를 필요로 vitripennis 문화는 바이러스의 수익성 수준을 생산의 발전에 매우 중요합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
침략 농업 종의 유입에 대한 상승 우려는 새로운 해충과 병원균에 대한 방어 할 수있는 새로운 방법론에 대한 수요 증가로 이어질했다. 질병 예방과 관리의 초점은 병원체 벡터의 관리를 포함하고이 연구의 주된 목표였다. 경제적 실용화가 큰 영역 위에 있지만 저비용 12에서 대량으로 필요하기 때문에 농업용 병원체 경로를 관리하는 생물 농약이 유형을 생성하는 결정에 중요한 역할을?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank the Texas Pierce’s Disease Research and Education Program and USDA-APHIS for their funding support for this project. We would also like to thank Hema Kothari at the University of Texas Health Science Center at Tyler for her assistance with confocal microscopy.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Corning cell culture flasks | Sigma Aldrich | CLS430168 | Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal) |
| Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71 | Olympus | Inverted microscope and camera | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma Aldrich | T4049 | 0.25%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA • 4Na per liter of Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates | Sigma Aldrich | M8937 | 48 wells (TC treated with lid) |
| DETCA | Sigma Aldrich | 228680 | Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma Aldrich | CLS431206 | Cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, membrane area 54.5 cm2, filter capacity 500 mL |
| Brij 52 | Sigma Aldrich | 388831 | Polyethylene glycol hexadecyl ether |
| Phosphate buffer solution | Sigma Aldrich | P5244 | Recieved as 100mM diluted to 10mM with sterile water |
| TRIzol LS | Life Technologies | 10296-028 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A5304 | For electrophoresis |
| Ethidium bromide | Sigma Aldrich | E7637 | BioReagent, for molecular biology, powder |
| QIAquick | Qiagen | 28704 | |
| QuantiTect qRT-PCR kit | Qiagen | 204243 | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | Reagent grade, crystalline |
| PBS | Sigma Aldrich | P5368 | Phosphate buffered saline |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| Rhodamine red-conjugated phalloidin | Life Technologies | R415 | Rhodamine phalloidin is a high-affinity F-actin probe conjugated to the red-orange fluorescent dye, tetramethylrhodamine |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Life Technologies | P36934 | |
| LSM510 Meta Confocal System | Carl Zeiss | ||
| LSM Zen 2007 Software | Carl Zeiss | ||
| Grace’s Insect medium (supplemented, 1X) | Sigma Aldrich | G8142 | H2G+ leafhopper medium component |
| L-histidine monohydrate | Sigma Aldrich | H8125 | H2G+ leafhopper medium component |
| Medium 199 (10X) | Sigma Aldrich | M4530 | H2G+ leafhopper medium component |
| Medium 1066 (1X) | Sigma Aldrich | C0422 | H2G+ leafhopper medium component |
| Hank’s Balanced Salts (1X) | Sigma Aldrich | 51322C | H2G+ leafhopper medium component |
| L-Glutamine (100X) | Sigma Aldrich | G3126 | H2G+ leafhopper medium component |
| MEM, amino acid mix (50X) | Sigma Aldrich | 56419C | H2G+ leafhopper medium component |
| 1 M MgCl solution | Sigma Aldrich | M8266 | H2G+ leafhopper medium component |
| Pen-Strep (w/ Glutamine) | Sigma Aldrich | G6784 | H2G+ leafhopper medium component |
| Nystatin | Sigma Aldrich | N6261 | H2G+ leafhopper medium component |
| Gentamycin | Sigma Aldrich | 46305 | H2G+ leafhopper medium component |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | H2G+ leafhopper medium component |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | H2G+ leafhopper medium component |
Riferimenti
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