Qui vi presentiamo un protocollo per propagare le cellule Homalodisca vitripennis e HoCV-1 in vitro. Media è stato rimosso dalla HoCV-1 colture positive e RNA estratto ogni 24 ore per 168 ore. Sopravvivenza cellulare è stata quantificata trypan colorazione blu. Particelle virali intere sono stati estratti dopo l'infezione. RNA estratto è stato quantificato da qRT-PCR.
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In questo articolo
Sommario
Abstract
Il cecchino vitreo-alato (Homalodisca vitripennis) è un insetto estremamente polifago vagili e presente in tutto il sud-ovest degli Stati Uniti. Questi insetti sono i vettori predominanti di Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), un batterio xilema limitata che è l'agente causale della malattia di Pierce (PD) della vite. Malattia di Pierce è economicamente dannoso; così, H. vitripennis sono diventati un bersaglio per le strategie di gestione del patogeno. Un dicistrovirus identificato come virus-01 Homalodisca coagulata (HoCV-01) è stata associata a un aumento della mortalità in H. popolazioni vitripennis. Perché una cellula ospite è necessaria per la replica HoCV-01, coltura cellulare fornisce un ambiente uniforme per la replica mirato che è logisticamente ed economicamente importante per la produzione di bio-pesticida. In questo studio, un sistema per la propagazione su larga scala da H. vitripennis cellule tramite coltura tissutale è stato sviluppato, providing un meccanismo di replicazione virale. HoCV-01 è stato estratto da insetti di tutto il corpo e utilizzato per inoculare H. colta vitripennis cellule a diversi livelli. Il terreno di coltura è stato rimosso ogni 24 ore per 168 ore, RNA estratto e analizzato con qRT-PCR. Le cellule sono state colorate con blu trypan e contati per quantificare la capacità di sopravvivenza delle cellule mediante microscopia ottica. Particelle virali intere sono stati estratti fino a 96 ore dopo l'infezione, che è stato il punto di tempo determinato per essere prima totale coltura cellulare crollo si è verificato. Le cellule sono state inoltre sottoposte a colorazione fluorescente e visualizzati mediante microscopia confocale per indagare l'attività virale su attaccamento e nuclei integrità F-actina. La conclusione di questo studio è che H. vitripennis cellule sono in grado di essere colta e utilizzata per la produzione di massa di HoCV-01 a un livello adeguato a consentire la produzione di un biopesticida.
Introduzione
Il cecchino vitreo-alato (Homalodisca vitripennis Germar 1821) è stata identificata come il vettore predominante di Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), l'agente causale della malattia di Pierce della vite (PD) in Nord America 1. Insetto gestione della popolazione è rapidamente diventato il centro della ricerca per combattere questo problema devastante per il settore della viticoltura in California e in tutto il sud degli Stati Uniti. Un positivo-senso, virus a RNA a singolo filamento appartenente alla famiglia Dicistroviridae, Homalodisca virus-01 coagulata (HoCV-01) è stata identificata in H. selvatici popolazioni <....
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Protocollo
Cultura 1. cellulare
NOTA: linee cellulari Homalodisca vitripennis stabiliti dal laboratorio Dr. Wayne Hunter presso l'USDA Agricultural Research Service (. Ft Pierce, FL USA) sono stati utilizzati per avviare un magazzino laboratorio composto da fasi cellulari misti inclusi i fibroblasti ei monostrati iniziali.
- Eseguire le seguenti procedure in un ambiente di laboratorio sterile mantenuta ad una temperatura compresa tra 20-24 ° C con 25 cm 2 fiasche di coltura.
- Coltivare e mantenere le culture in 25 cm 2 fiasche di coltura tissutale utilizzando H2G + Leafhopper medio, una versione m....
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Risultati
Attaccamento delle cellule e la crescita è stato visto in 48 ore di passaggio in piccole e grandi fiasche di coltura, da colture primarie e continui passaggi. Crescita dei fibroblasti e sviluppo è stata osservata anche in questo lasso di tempo. Quando fiaschi appena seminati sono stati disturbati prima di 48 ore, c'è stato un calo visibile in adesione cellulare, portando a culture crescita più lenti ea volte senza attaccamento o di crescita a tutti. Le cellule sono state circa il 80% confluenti entro una settimana d.......
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Discussione
L'aumento preoccupazioni per quanto riguarda l'afflusso di specie invasive agricole hanno portato ad un aumento della domanda di nuove metodologie per la difesa contro i parassiti e patogeni emergenti. Un focus di prevenzione e gestione della malattia comporta la gestione di vettori patogeni ed era l'obiettivo primario di questo studio. Economia svolgono un ruolo fondamentale nella decisione di produrre questo tipo di biopesticida per gestire vettori di patogeni in agricoltura perché l'applicazione prati.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare il Texas Pierce's Disease Research and Education Program e USDA-APHIS per il loro sostegno finanziario a questo progetto. Vorremmo anche ringraziare Hema Kothari dell'Università del Texas Health Science Center di Tyler per la sua assistenza con la microscopia confocale.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Fiasche per colture cellulari Corning | Sigma Aldrich | CLS430168 | Superficie 25 cm2, collo inclinato, tappo (tappo di tenuta) |
| Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71 | Olympus | Microscopio invertito e fotocamera | |
| Soluzione tripsina-EDTA | Sigma Aldrich | T4049 | 0,25%, filtrato sterile, BioReagente, adatto per colture cellulari, 2,5 g di tripsina suina e 0,2 g di EDTA & toro; 4Na per litro di Hanks′ Soluzione salina bilanciata con rosso fenolo |
| Piastre di coltura multipozzetto Greiner CELLSTAR | Sigma | Aldrich M8937 | 48 pozzetti (TC trattato con coperchio) |
| DETCA | Sigma Aldrich | 228680 | Sodio dietilditiocarbammato triidrato |
| Sistema di filtraggio sottovuoto per flaconi Corning | Sigma Aldrich | CLS431206 | Membrana in acetato di cellulosa, dimensione dei pori 0,45 μ m, area della membrana 54,5 cm2, capacità del filtro 500 ml |
| Brij 52 | Sigma Aldrich | 388831 | Polietilenglicole esadecil etere |
| Soluzione tampone fosfato | Sigma Aldrich | P5244 | Ricevuto come 100 mM diluito a 10 mM con acqua sterile |
| TRIzol LS | Life Technologies | 10296-028 | |
| Agarosio | Sigma Aldrich | A5304 | Per elettroforesi |
| Bromuro di etidio | Sigma Aldrich | E7637 | BioReagent, per biologia molecolare, polvere |
| QIAquick | Qiagen | 28704 | |
| QuantiTect qRT-PCR kit | Qiagen | 204243 | |
| 4% paraformaldeide | Sigma Aldrich | P6148 | Reagente grado, cristallino |
| PBS | Sigma Aldrich | P5368 | Fosfato soluzione salina tamponata |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| Falloidina coniugata con rosso rodamina | Life Technologies | R415 | La falloidina della rodamina è una sonda F-actina ad alta affinità coniugata al colorante fluorescente rosso-arancio, la tetrametilrodamina |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| ProLong Gold Reagente Antifade | Life Technologies | P36934 | |
| LSM510 Sistema metaconfocale | Carl Zeiss | ||
| LSM Zen 2007 Software | Carl Zeiss | ||
| Grace' s Insetto medio (integrato, 1x) | Sigma Aldrich | G8142 | H2G+ cicalina medio componente |
| L-istidina monoidrato | Sigma Aldrich | H8125 | H2G+ cicalina medio componente |
| Medio 199 (10x) | Sigma Aldrich | M4530 | H2G+ cicalina medio componente |
| Medio 1066 (1x) | Sigma Aldrich | C0422 | H2G+ cicalina medio componente |
| Hank' s Sali bilanciati (1x) | Sigma Aldrich | 51322C | H2G+ cicalina componente media |
| L-Glutammina (100x) | Sigma Aldrich | G3126 | H2G+ cicalina componente media |
| MEM, miscela di aminoacidi (50x) | Sigma Aldrich | 56419C | H2G+ cicalina componente media |
| 1 M soluzione MgCl | Sigma Aldrich | M8266 | H2G+ cicalina componente media |
| Pen-Strep (con / glutammina) | Sigma Aldrich | G6784 | H2G+ cicalina componente media |
| Nistatina | Sigma Aldrich | N6261 | H2G+ cicalina componente media |
| Gentamicina | Sigma Aldrich | 46305 | H2G+ cicalina componente media |
| Destrosio | Sigma Aldrich | D9434 | H2G+ cicalina componente media |
| Fetale Siero bovino | Sigma Aldrich | F2442 | H2G+ cicalina componente media |
Riferimenti
- Takiya, D. M., McKamey, S. H., Cavichioli, R. R. Validity of Homalodisca and of H. vitripennis as the Name for Glassy-winged Sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae: Cicadellinae). Ann. Entomol. Soc. Am. 99 (4), 648-655 (2006).
- Hunter, W. B., Katsar, C. S., Chaparro, J. X.
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Ristampe e permessi
