Strategier for Tracking Anastasis en celle Survival fænomen, Vender Apoptose

Summary

The term anastasis refers to the phenomenon in which dying cells reverse a cell suicide process at a late stage, repair themselves, and ultimately survive. Here we demonstrate protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis.

Abstract

Anastasis (græsk for "stigende til liv") henviser til inddrivelse af døende celler. Før disse celler komme sig, har de passeret vigtige checkpoints af apoptose, herunder mitokondrie fragmentering, frigivelse af mitokondrie cytochrom c i cytosolen, aktivering af caspaser, chromatinkondensering, DNA-skader, nuklear fragmentering, plasma membranblæredannelse, celle krympning, celleoverfladeeksponering af phosphatidylserin og dannelse af apoptotiske legemer. Anastasis kan opstå, når apoptotiske stimuli fjernes før døden, hvorved døende celler at vende apoptose og potentielt andre død mekanismer. Derfor synes Anastasis at involvere fysiologiske helbredende processer, der også kan opretholde beskadigede celler uhensigtsmæssigt. De funktioner og mekanismer Anastasis er stadig uklart, hæmmes dels af de begrænsede værktøjer til påvisning af tidligere begivenheder efter inddrivelse af tilsyneladende raske celler. Strategier til at påvise Anastasis vil sætte undersøgelser af de fysiologiske mekanismer, faren ved udøde celler i sygdom patologi og potentielle lægemidler til at modulere Anastasis. Her beskriver vi effektive strategier via levende celler mikroskopi og en pattedyr caspase biosensor til identifikation og sporing Anastasis i pattedyrsceller.

Introduction

Apoptose (græsk for "at falde til døden") generelt antages at være en ensrettet proces ender i celle selvmord ^1-7. Genetisk afbrydelse af pro-dødsgener resulterer i overlevelse ekstra celler, der ellers ville dø i hele dyr, herunder celler, der er allerede iværksat apoptose pathway ^8,9. Tilsvarende genetiske manipulationer tillader sunde pattedyrceller, der kunstigt vise "Eat Me" signaler eller der mister klæbeevne til deres ekstracellulære matrix at undslippe døden ved hel celle fagocytose eller entosis henholdsvis ^10,11. Men vi og andre har vist, at uden genmanipulation normale pattedyrceller sunde og cellelinier kan også komme fra de tidlige stadier af apoptose ^12-15. Brug værktøjer til at spore individuelle celler, har vi yderligere demonstreret genrejsning sene stadier af apoptose ^12,13, efter at cellerne er gået vigtige checkpoints at typiskely markere "point of no return" ^2-6. Disse checkpoints for sent tidspunkt apoptose omfatte mitokondrie frigivelse af cytochrom c, aktivering af caspaser, nuklear fragmentering, og dannelse af apoptotiske legemer. Vi vedtog en græsk sammensatte ord "Anastasis", som betyder "stigende til liv", til at beskrive denne tilbageførsel af apoptose på randen af celledød ^2-6.

Medmindre hele døende inddrivelse proces overholdes af levende celler, er det en udfordring at adskille celler, der har undergået Anastasis fra celler, der aldrig har oplevet apoptotiske begivenheder. Årtiers arbejde har vist, at de morfologiske træk celle selvmord ved apoptose er drevet af evolutionært konserverede biokemiske og molekylære begivenheder ^16-19. Disse begivenheder fremmer selvdestruktion af celler til at regulere udviklingsmæssige og homoeostatic processer i encellede og flercellede organismer ved at fjerne beskadiget eller dFARLIGT celler ^16-19. Mens apoptotiske celler kan let skelnes ved standardiserede morfologiske, biokemiske og molekylære manifestationer af apoptose ^1,5,6,16,20, i øjeblikket er der ingen kendt markør specifikke for Anastasis ^12,13. Vigtigt er det, celler, der har undergået Anastasis synes at være normale, sunde celler og celler, der bare begynde at vende apoptose vises som apoptotic døende celler ^12,13. Således er nye værktøjer er nødvendige for at konkludere med sikkerhed, at en given overlevende celle tidligere havde oplevet aktive apoptotiske processer.

Apoptose antages generelt som en irreversibel kaskade, fordi det er en hurtig og massiv proces ødelæggelse. Mens det kan tage minutter til dage for nogle celler til at indlede apoptose, når mitochondrier har frigivet apoptogenic faktorer såsom cytochrom c i cytosolen ^21,22 kan caspaser aktiveres inden for 5 minutter ^23,24, efterfulgt af cytoplasmatiske ognuklear kondens inden for 10 min ^25-27, og celledød kort derefter ^25-27. Aktiverede caspaser iscenesætte apoptose ved at spalte og inaktivere vigtige strukturelle og funktionelle komponenter med henblik på cellulær nedrivning ^2,28, såsom endonuklease inhibitor DFF45 / ICAD ^29,30. Caspaser også aktivere pro-apoptotiske faktorer, såsom Bcl-2 familiemedlem BID, som translokerer for mitokondrier at fremme mitochondrial frigivelse af cytochrom c ^31,32. Caspaseaktivitet resulterer også i celleoverfladen af phosphatidylserin som en "spise mig" signal til fremme engulfment af døende celler af makrofager eller nabo celler gennem fagocytose ^33. Desuden apoptotiske begivenheder gør mitokondrier dysfunktionelle, forstyrre cellulære bioenergetik og stofskifte ^34,35,36. Således synes intuitivt usandsynligt genrejsning destruktionen.

I modsætning til den oprindelige forventetioner kan celler vende apoptotisk celledød proces selv på et sent tidspunkt. Ved løbende at overvåge skæbne døende celler i kultur, observerede vi reversibiliteten af sent stadium apoptose i en række primære celler og cellelinier ^12,13. Fjernelse af død stimulus tilladt indvinding fra de åbenlyse funktioner i apoptose, såsom mitokondrie fragmentering, chromatinkondensering, DNA-skader, plasma membranblæredannelse, celleoverfladen af phosphatidylserin, frigivelse af mitokondrie cytochrom c, caspaseaktivering, nuklear fragmentering, celle svind, og dannelse af apoptotiske legemer. Disse observationer rejser ubesvarede spørgsmål om de funktioner, konsekvenser, og mekanismerne i Anastasis. For at løse disse spørgsmål, en forudsætning er at pålideligt identificere celler, der har undergået Anastasis. Her beskriver vi live mikroskopi metoder og en caspase biosensor til påvisning af celler, der tidligere har vendt sent apoptose og then overlevede.

Protocol

1. Fremstilling af celler til live Cell Imaging For at lette påvisning af morfologiske ændringer ved at vælge adhærente celler, såsom HeLa (human cervical carcinoma) celler, der er fladt på underlaget bedre at visualisere ændring af plasmamembranen og intracellulære organeller. Bemærk: Tilbageførsel af apoptose er blevet observeret i forskellige pattedyrceller 12,13, herunder primær muselever, primærbatterier musemakrofager, primære rottecardiomyocytter samt cellelinier, såsom …

Representative Results

For at undersøge tilbageførsel af apoptose, er vævskulturceller først udsat for en død stimulus til at udløse apoptose. Når cellerne vise kendetegnende for apoptose, er frisk dyrkningsmedium derefter anvendt til at vaske væk stimulus og derefter inkuberes de døende celler til at tillade genvinding (figur 1A). Her er det centrale spørgsmål, der behandles, er, hvor langt de enkelte dør dyrkede celler kan fremskridt i retning af apoptose og stadig undergår Anastasis. Dette spørgsmål kan ende…

Discussion

Anastasis refererer til det fænomen, hvor celler, der har aktiveret celledød vej senere vende dødsprocessen og overleve. Her har vi vist, at levende celler kan bruges til at bekræfte, at de samme individuelle celler i virkeligheden kan vende apoptotisk celledød proces på et sent tidspunkt, og derefter fortsætte overlevende og reproducere. Vores protokoller beskriver flere optimeret celletype-specifik behandling betingelser for at inducere apoptose og tillader en stor del af cellerne til at gennemgå tilbageførse…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
LSM780 confocal microscopy	Carl Zeiss	/
Glass bottom culture dish	MatTek Corporation	P35G-0-14-C
Transparent CultFoi	Carl Zeiss	000000-1116-084
CO2 independent medium	Life Technologies	18045-088
CellTracker	Life Technologies	C34552
Mitotracker Red CMXRos	Life Technologies	M-7512
Hoechst 33342	Life Technologies	H1399
Fluorescently labeled annexin V	Biovision	K201