حقن مثلي من خلايا سرطان الثدي في الثديية الدهون وسادة من الفئران لدراسة نمو الأورام.

Summary

السرطان مرض معقد يتأثر الأنسجة المحيطة للورم، وكذلك المؤيد المحلية والمضادة للالتهابات وسطاء. لذلك، ونماذج حقن المتعامدة التغاير، بدلا من نماذج تحت الجلد قد تكون مفيدة لدراسة تطور سرطان بطريقة يحاكي أفضل علم الأمراض البشرية.

Abstract

يمكن دراسة نمو سرطان الثدي في الفئران باستخدام مجموعة كبيرة من النماذج. التلاعب الجيني للخلايا سرطان الثدي يمكن أن توفر نظرة ثاقبة وظائف البروتينات المشاركة في التقدم أنكجنيك أو مساعدة لاكتشاف المكثفات الورم جديدة. وبالإضافة إلى ذلك، حقن الخلايا السرطانية في الفئران مع الأنماط الجينية المختلفة قد توفير فهم أفضل لأهمية المقصورة اللحمية. قد يكون العديد من النماذج مفيدة للتحقيق في جوانب معينة من تطور المرض ولكن لا ألخص عملية السرطانية بأكملها. في المقابل، خلايا سرطان الثدي engraftment إلى لوحة الدهون الثديية من الفئران أفضل يلخص موقع للمرض وجود مقصورة انسجة سليمة وبالتالي يحاكي أفضل مرض سرطاني البشري. في هذه المقالة، نحن تصف كيفية زرع خلايا سرطان الثدي في الفئران orthotopically وشرح كيفية جمع الأنسجة لتحليل: 14px؛ خط الطول: 28px؛ "> ورم الوسط والانبثاث إلى أعضاء بعيدة عن طريق هذا النموذج، العديد من الجوانب (النمو، والأوعية الدموية، والانبثاث) من السرطان يمكن تحقيق ذلك ببساطة عن طريق توفير البيئة المناسبة لخلايا الورم في النمو.

Introduction

السرطان مرض معقد جدا التي كانت تخضع لدراسات لأكثر من قرون. سرطان الثدي هو نوع السرطان الأكثر شيوعا. يحدث في الغالب في الإناث ولكن قد يحدث أيضا بشكل متقطع في الذكور ^27. وينجم هذا المرض أساسا عن فقدان آلية السيطرة انقسام الخلايا الحكم والذي بدوره يؤدي إلى نمو لا حصر له من الخلايا في الجسم. يمكن أن يكون سبب هذه الأعطال من قبل عدة آليات: أولا، الخلايا السليمة تحتاج إشارات نمو من الخلايا المحيطة بها من أجل تتكاثر الخلايا السرطانية في حين تجعل عوامل النمو الخاصة بها وتزيد من التعبير عن مستقبلات عوامل النمو وبالتالي الحصول على أعلى معدل التكاثري ^1؛ الثانية، الخلايا السرطانية هي أقل عرضة للإشارات مكافحة التكاثري ^8؛ ثالثا، لتحقيق التوازن في عدد الخلايا في مطلوب أيضا وفاة خلية من خلايا الجسم. ومع ذلك، الخلايا السرطانية الهروب من موت الخلايا المبرمج، وصفته موت الخلايا المبرمج ^14؛ الرابع، وخلايا تلتزم مصفوفات خارج الخليةمن أجل البقاء على قيد الحياة ولكن الخلايا السرطانية يمكن أن تنمو من دون الحاجة إلى التعلق وتظهر مقاومة anoikis ^19. الخامس وتفعيل التيلوميراز تلتف تقصير التيلومير ويمنع الشيخوخة تنسخي ^21؛ أخيرا وليس آخرا، تخطي مراقبة الجودة DNA التالية النتائج الانقسام في المحتوى الجيني تغير ^15،16. من أجل تحديد الجينات المسرطنة أو المكثفات الورم التي تلعب دورا في هذا الانتشار المحررة من القيود التنظيمية، والتجارب نمو الورم في الفئران هي الحاسمة.

نمو الورم الرئيسي عموما ليست السبب الرئيسي للوفاة. هجرة الخلايا السرطانية من الموقع الأساسي إلى موقع ثانوي، يطلق ورم خبيث، هو السبب الرئيسي للوفاة في معظم مرضى السرطان ^22. ورم خبيث ينطوي غزو الخلايا السرطانية، دخول الوعاء، والسفر من خلال الدورة الدموية، وتجنب المناعة الهجوم، التسرب والنمو في الموقع الثانوي. الظهارية للانتقال الوسيطة (EMT) هو عملية أساسية فيورم خبيث وينطوي على التبديل في ملامح التعبير الجيني العائد الخلايا مع ارتفاع الحركة والغازية، والتي هي بمستلزمات للخلية نقيلي ^12. ولما كانت عملية السرطانية هي حصيلة مجموعة من الإجراءات المختلفة، بما في ذلك التفاعلات المتبادلة بين الخلايا السرطانية والخلايا اللحمية والخلايا المؤيدة والمضادة للالتهابات، وهو نهج في المختبر بالسرطان في كثير من الأحيان لا توفر رؤية كاملة في عملية السرطانية. وبالمثل، والعلاجات المضادة للسرطان تؤثر على الأوعية الدموية السرطانية يمكن في كثير من الأحيان لا يتم دراستها في المختبر، وبالتالي فإن استخدام الجسم الحي في النهج أمر لا مفر منه.

لدراسة تطور سرطان الثدي، وقد وضعت الطرق التجريبية المختلفة. النموذج الأكثر استخداما هو الحقن تحت الجلد من خلايا سرطان الثدي في الفئران ^5. في هذا الإعداد التجريبية، يجوز للمحقق تقديم مجموعة واسعة من التعديلات على خط خلية من خيار في المختبر (أيupregulation، downregulation من البروتينات) وحقن الخلايا تحت الجلد. على الرغم من أن هذه الطريقة هي واضحة وعملية حقن بسيطة دون الحاجة إلى إجراء عمليات جراحية على الفئران، الموقع الذي يتم حقن الورم لا يمثل البيئة الورم الثديية المحلية وغياب هذه البيئة قد يؤدي إلى الإصابة بسرطان الثدي الذي يختلف عن تلك التي لوحظت في علم الأمراض البشرية. ثانيا، تستخدم فئران معدلة وراثيا في كثير من الأحيان كأداة في الجسم الحي لدراسة تطور سرطان الثدي. في هذا النموذج، هو الدافع وراء الجين الورمي (أي PyMT، نوي) التعبير من قبل المروج محدد الأنسجة الثديية مما أدى إلى تشكيل عفوية ورم الثدي الصورة. هذا الإعداد التجريبية مفيد لدراسة جوانب العلاج من هذا المرض عن طريق حقن المخدرات أو الأجسام المضادة أثناء التحقق من حجم الورم في الوقت المناسب ^3. ومع ذلك، تربية هذه الفئران مع سلالات الفئران الأخرى ناقصة أو تحور في الجينات في المصالح ويمكن أيضا إعطاء الإضافيةights في دور البروتينات المختلفة في نمو الورم الثدي ^24. الجانب السلبي من هذا النموذج هو أنه عرضة للتفاوت في حجم الورم والعدد. وعلاوة على ذلك، فإن مستوى التعبير التحوير يعتمد على موقع التكامل في الجينوم، ويمكن أن تتغير من سلالة الماوس واحد إلى ⁴ آخر. في هذا النموذج، والتعبير عن التحوير يمكن أن يتحقق من قبل جميع الخلايا الظهارية مع الأصل بينما في الأمراض التي تصيب البشر، فقط جزء من السكان من الخلايا التعبير عن الجين الورمي أو downregulate مستويات الكابتة للورم ^26. لدراسة ورم خبيث، ويمكن أيضا أن حقن خلايا سرطان الثدي عن طريق الوريد (نموذج يسمى ورم خبيث تجريبي) ^25. ومع ذلك، فإن هذا النهج يلخص فقط عملية المنتشر جزئيا. انها تلتف شرط للخلايا السرطانية لغزو وintravasate، ويبدأ من النقطة التي الخلايا السرطانية هي بسهولة الموجودة في التداول.

في عملنا، ونحن استخدام حقن مثليأيون نموذج لدراسة تورط الجينات في المصالح في تطور سرطان الثدي ^13. نحن بإفراط عن البروتين في خلايا سرطان الثدي البشرية وضخها إلى لوحة الدهون الثديية من NOD / غاما SCID (مجموعة موردي المواد النووية) الفئران. هذه الطريقة هو مفيد من نواح عديدة: فهو يسمح التغيرات الجينية السريعة جدا ومتنوعة في خط الخلية حقن، فإنه يغطي كامل عملية تطور سرطان الثدي من نمو الورم الرئيسي لورم خبيث في المواقع ذات الصلة مرضي، وأنه يوفر أيضا نموذج تجريبي جيد لدراسة تأثير العلاجات العلاجية في مراحل مبكرة أو متأخرة من المرض. وبالإضافة إلى ذلك، وذلك باستخدام هذا النموذج يمكن لأحد أن التحقيق في دور انسجة مقابل السرطان البروتينات المشتقة من خلية في تطور المرض باستخدام الفئران المعدلة وراثيا أو الخلايا. وعلى الرغم من الحقن تحت الجلد هي أسهل لأداء، ونماذج مثلي تؤدي إلى نشوء الخلايا السرطانية أكثر السكان مكون للأورام وأكثر النقيلي. وهكذا، والنتائج التي تم الحصول عليها عن طريق الحقن تحت الجلدالصورة قد تكون إما كاذبة أو سلبي إيجابية كاذبة ^6،17 تشجيع استخدام نماذج مثلي لدراسة نمو الورم.

Protocol

وتمت الموافقة على التجارب على الحيوانات من قبل لجنة الرفق بالحيوان من المركز الطبي لجامعة لايدن (LUMC). 1. إعداد الخلايا، أدوات والفئران وقبل يوم من العملية، ويحلق في NOD / SCID جاما (مجم?…

Representative Results

ويستند التطبيق الناجح ل"نموذج سرطان الثدي مثلي" على حقن السليم من الخلايا في لوحة الدهون الثديية. أخطاء التجريبية مثل التلقيح غير دقيق من الخلايا أو تسرب قد يؤدي إلى اختلافات في حجم الورم أو حتى عدم وجود الورم الذي يؤدي إلى تشكيل هيكل أبحث مشابهة لمنصة الدهون ال?…

Discussion

حقن مثلي من خلايا سرطان الثدي هو نموذج قوي لدراسة جميع جوانب نمو السرطان. زرع هذه الخلايا في لوحة الدهون الثديية من الفئران يجب أن يتم تنفيذ بعناية من أجل منع التباين في نمو الورم. الأهم من ذلك، حقن نفس الكمية من الخلايا لكل فأر أمر بالغ الأهمية. للقيام بذلك، ينبغي للم?…

Materials

Name of material/equipment	Company	Catalog number	Comments/Description
Bouin's solution	Sigma-Aldrich	HT10132	Used for investigating the metastasis on lungs
Formalin solution	Sigma-Aldrich	HT501128	Used to fix the tissues
Matrigel, growth factor reduced	Corning	356230	Cells can be resuspended in matrigel for injection
Mosquito forceps	Fine Science Tools	13008-12	Used for stiching
Angled forceps	Electron microscopy sciences	72991-4c	These make the exposure of mammary fat pad easier
Scissors	B Braun Medicals	BC056R	Used to cut open the mice
Straight forceps	B Braun Medicals	BD025R	This is used to open up the skin to expose mammary fat pad
NOD scid gamma mice	Charles River	005557	Experimental animal used for experiment
MDA-MB-231	Sigma-Aldrich	92020424	Experimental cells used for injections
Oculentum simplex	Teva Pharmachemie		Opthalmic ointment used to prevent drying out of eyes
Betadine	Fischer Scientific	19-898-859	Ionophore, used to disinfect the surgical area
Xylazin/Ketamine	Sigma-Aldrich	X1251, K2753	Use injected anesthesia as 10mg/kg and 100mg/kg body weight respectively
Temgesic	Schering-Plough		Use the painkiller as 0,05-0,1mg/kg body weight
DMEM	Life sciences	11995	For trypsin neutralization,use media with serum(FBS:media 1:10 volume); for injection, use media with no serum
Buffered sodium citrate	Aniara	A12-8480-10	Use the volume ratio as citrate:blood; 1:9