Orthotopische Injectie van borstkankercellen in de uiervet Pad van Muizen tumorgroei te bestuderen.
Summary
Kanker is een complexe ziekte die wordt beïnvloed door het weefsel rondom de tumor en lokale pro- en anti-inflammatoire mediatoren. Daarom kan orthotroop injectie modellen plaats subcutane modellen nuttig om de progressie van kanker te bestuderen op een wijze die beter nabootst humane pathologie.
Abstract
Borstgroei kanker kan worden bestudeerd in muizen met behulp van een overvloed aan modellen. Genetische manipulatie van borstkankercellen kan inzicht in de functie van eiwitten die betrokken zijn bij oncogene progressie of hulp aan nieuwe tumor suppressors ontdekken. Bovendien injecteren kankercellen in muizen met verschillende genotypen misschien beter begrip van het belang van het stromale compartiment verschaffen. Veel modellen kan nuttig zijn om bepaalde aspecten van ziekteprogressie te onderzoeken maar niet herhalen het gehele kankerproces. Daarentegen borstkankercellen enting de uiervet pad muizen betere recapituleert de plaats van de ziekte en de aanwezigheid van het juiste stromale compartiment en dus beter nabootst humane kankerachtige ziekten. In dit artikel beschrijven we hoe je de cellen van borstkanker te implanteren in muizen orthotopically en uitleggen hoe je weefsels aan het analyseren verzamelen: 14px; line-height:. 28px; "> tumor milieu en metastase naar verre organen Met dit model vele aspecten (groei, angiogenese en metastase) kanker kan eenvoudig worden onderzocht door een geschikte omgeving voor tumorcellen groeien.
Introduction
Kanker is een zeer complexe ziekte die onderworpen is geweest aan studies voor de eeuwen heen. Borstkanker is de meest voorkomende vorm van kanker; Het komt voornamelijk bij vrouwen, maar kan sporadisch ook voorkomen bij mannen 27. De ziekte wordt voornamelijk veroorzaakt door het verlies van regelmechanisme besturen celdeling wat leidt tot een oneindige groei van cellen in het lichaam. Deze storingen kunnen worden veroorzaakt door verschillende mechanismen: enerzijds gezonde cellen hebben groei signalen van de omringende cellen om te prolifereren terwijl kankercellen hun eigen groeifactoren en verhoging van de expressie van groeifactorreceptoren dus een hogere snelheid proliferatieve 1 verkrijgen; tweede kankercellen zijn minder gevoelig voor anti-proliferatieve signalen 8; derde, het aantal cellen in het lichaam celdood is ook vereist evenwicht; echter kankercellen ontsnappen van geprogrammeerde celdood, apoptose genaamd 14; vierde cellen zich aan extracellulaire matricesom te overleven, maar tumorcellen kan groeien zonder de noodzaak van hechting en weerstand tegen anoikis 19 tonen; vijfde, activering van telomerase omzeilt de telomeerverkorting en voorkomt de replicatieve senescentie 21; last but not least, het overslaan van DNA kwaliteitscontrole volgende mitose resultaten in gewijzigde genetische inhoud 15,16. Om oncogenen of tumor suppressors die een rol spelen gedereguleerde proliferatie identificeren tumorgroei experimenten bij muizen cruciaal.
Primaire tumor groei is over het algemeen niet de belangrijkste reden van de dood. Migratie van kankercellen van de primaire locatie naar een tweede locatie, genoemd metastase, is de belangrijkste doodsoorzaak in de meeste kankerpatiënten 22. Metastase meebrengt tumorcelinvasie, intravasation, reizen door de circulatie, het vermijden immuun aanval, extravasatie en groei op de secundaire locatie. Epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT) is een belangrijk proces inmetastase en het gaat om een schakelaar in genexpressie profielen waardoor cellen met een hogere beweeglijkheid en invasiviteit, die voorwaarden zijn voor de metastasizing cel 12 zijn. Omdat de kankercellen proces is de resultante van een combinatie van verschillende acties, inclusief de wederzijdse interacties tussen kankercellen, stromale cellen en pro- en anti-inflammatoire cellen, een in vitro benadering van kanker vaak niet tot het inzicht in het kankerproces. Ook behandelingen tegen kanker invloed op de tumor vasculatuur kan vaak niet worden bestudeerd in vitro, waardoor het gebruik van in-vivo-benaderingen is onvermijdelijk.
Om borstkanker progressie te bestuderen, hebben verschillende experimentele methoden ontwikkeld. De meest gebruikte model is de subcutane injectie van borstkankercellen in muizen 5. In deze experimentele opstelling kan de onderzoeker diverse wijzigingen aan te brengen aan een cellijn naar keuze in vitro (dwzopregulatie, downregulatie van eiwitten) en injecteer de cellen onder de huid. Hoewel deze methode is eenvoudig en het injectieproces is eenvoudig zonder dat zij opereren op muizen, is de plaats waar de tumor geïnjecteerd niet de lokale borsttumor omgeving en zonder deze milieu vormen kan resulteren in de ontwikkeling van borstkanker die afwijkt van die in menselijke pathologie. Tweede genetisch gemanipuleerde muizen vaak gebruikt als een in vivo middel borstkanker progressie bestuderen. In dit model wordt oncogen (dwz PyMT, Neu) expressie aangedreven door een borstklierweefsel promotor leidt tot de vorming van spontane borsttumor s. Deze experimentele opstelling is nuttig voor de behandeling aspect van de ziekte te bestuderen door het injecteren van geneesmiddelen of antilichamen terwijl inchecken tumorgrootte tijd 3. Echter, het kweken van deze muizen met andere muizenstammen deficiënt of gemuteerd in een gen van belang kan ook ins gevenECHTEN naar de rol van verschillende eiwitten in moedermelk tumorgroei 24. Het nadeel van dit model is dat het gevoelig voor variatie in tumorgrootte en nummer. Bovendien is het niveau van transgenexpressie afhankelijk van de integratieplaats in het genoom en kan van de ene naar de andere muizenstam 4. In dit model kan de expressie van het transgen worden bereikt door alle cellen van epitheliale oorsprong dat in menselijke ziekte, slechts een subpopulatie van cellen brengen het oncogen of downregulate de tumor suppressor niveau 26. Om metastase studeren, borstkankercellen ook intraveneus worden geïnjecteerd (een model genoemd experimentele metastase) 25. Echter, deze aanpak recapituleert alleen de metastatische proces gedeeltelijk; Het omzeilt het vereiste tumorcellen binnen te dringen en intravasate en begint vanaf het punt waarop tumorcellen gemakkelijk aanwezig in de circulatie.
In ons werk gebruiken we een orthotopic injecterenion model om de betrokkenheid van de genen van belang bij borstkanker progressie 13 bestuderen. We overexpressie van het eiwit in menselijke borstkankercellen en injecteren ze in de uiervet pad van NOD / SCID-gamma (NSG) muizen. Deze werkwijze is voordelig in veel opzichten: het maakt zeer snelle en verschillende genetische veranderingen in de geïnjecteerde cellijn, bestrijkt het gehele proces van borstkanker progressie van primaire tumor groei metastase bij pathologisch relevante sites, en ook een goede experimenteel model voor het bestuderen van het effect van therapeutische behandelingen in vroege of late stadia van de ziekte. Voorts worden volgens dit model kan de rol van stromale versus kankercellen afkomstige eiwitten ziekteprogressie door gebruik van genetisch gemodificeerde muizen of cellen te onderzoeken. Hoewel subcutane injecties zijn makkelijker uit te voeren, orthotopische modellen leiden tot een tumorigene en metastatische kanker celpopulatie. Zo resultaten verkregen met subcutane injecties kunnen ofwel vals-negatieve of vals-positieve 6,17 stimuleren van het gebruik van orthotopische modellen om de tumorgroei te bestuderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Orthotope injectie van borstkankercellen is een krachtig model voor alle aspecten van de groei van kanker te bestuderen. Implantatie van deze cellen in de uiervet pad van de muizen zorgvuldig worden uitgevoerd om de variatie in tumorgroei voorkomen. Het belangrijkste injecteren dezelfde hoeveelheid cellen aan elke muis cruciaal. Om dit te doen, moet men de cellen trypsinize rigoureus zonder dat de levensvatbaarheid van de cellen. Niet-levensvatbare cellen worden genegeerd tijdens het tellen van cellen en reagentia (…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the Netherlands Organization for Scientific Research (NWO, grant 17.106.329)
Materials
| Name of material/equipment | Company | Catalog number | Comments/Description |
| Bouin's solution | Sigma-Aldrich | HT10132 | Used for investigating the metastasis on lungs |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | Used to fix the tissues |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 356230 | Cells can be resuspended in matrigel for injection |
| Mosquito forceps | Fine Science Tools | 13008-12 | Used for stiching |
| Angled forceps | Electron microscopy sciences | 72991-4c | These make the exposure of mammary fat pad easier |
| Scissors | B Braun Medicals | BC056R | Used to cut open the mice |
| Straight forceps | B Braun Medicals | BD025R | This is used to open up the skin to expose mammary fat pad |
| NOD scid gamma mice | Charles River | 005557 | Experimental animal used for experiment |
| MDA-MB-231 | Sigma-Aldrich | 92020424 | Experimental cells used for injections |
| Oculentum simplex | Teva Pharmachemie | Opthalmic ointment used to prevent drying out of eyes | |
| Betadine | Fischer Scientific | 19-898-859 | Ionophore, used to disinfect the surgical area |
| Xylazin/Ketamine | Sigma-Aldrich | X1251, K2753 | Use injected anesthesia as 10mg/kg and 100mg/kg body weight respectively |
| Temgesic | Schering-Plough | Use the painkiller as 0,05-0,1mg/kg body weight | |
| DMEM | Life sciences | 11995 | For trypsin neutralization,use media with serum(FBS:media 1:10 volume); for injection, use media with no serum |
| Buffered sodium citrate | Aniara | A12-8480-10 | Use the volume ratio as citrate:blood; 1:9 |
Riferimenti
- Aaronson, S. A. Growth factors and cancer. Science. 254 (5035), 1146-1153 (1991).
- Bao, L., Matsumura, Y., Baban, D., Sun, Y., Tarin, D. Effects of inoculation site and Matrigel on growth and metastasis of human breast cancer cells. Br. J. Cancer. 70 (2), 228-232 (1994).
- Brouxhon, S. M., et al. Monoclonal antibody against the ectodomain of E-cadherin (DECMA-1) suppresses breast carcinogenesis: involvement of the HER/PI3K/Akt/mTOR and IAP pathways. Clin. Cancer Res. 19 (12), 3234-3246 (2013).
- Dobie, K. W., et al. Variegated transgene expression in mouse mammary gland is determined by the transgene integration locus. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 93 (13), 6659-6664 (1996).
- Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma. Anticancer Res. 25 (6B), 3905-3915 (2005).
- Fidler, I. J., Naito, S., Pathak, S. Orthotopic implantation is essential for the selection, growth and metastasis of human renal cell cancer in nude mice [corrected. Cancer Metastasis Rev. 9 (2), 149-165 (1990).
- Fridman, R., et al. Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel. J. Natl. Cancer Inst. 83 (11), 769-774 (1991).
- Fynan, T. M., Reiss, M. Resistance to inhibition of cell growth by transforming growth factor-beta and its role in oncogenesis. Crit Rev. Oncog. 4 (5), 493-540 (1993).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J. Biomed. Sci. 17, 36 (2010).
- Iorns, E., et al. A new mouse model for the study of human breast cancer metastasis. PLoS. One. 7 (10), e47995 (2012).
- Jessani, N., Niessen, S., Mueller, B. M., Cravatt, B. F. Breast cancer cell lines grown in vivo: what goes in isn’t always the same as what comes out. Cell Cycle. 4 (2), 253-255 (2005).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J. Clin. Invest. 119 (6), 1420-1428 (2009).
- Kocaturk, B., et al. Alternatively spliced tissue factor promotes breast cancer growth in a beta1 integrin-dependent manner. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, 11517-11522 (2013).
- Lowe, S. W., Lin, A. W. Apoptosis in cancer. Carcinogenesis. 21 (3), 485-495 (2000).
- Meek, D. W. The p53 response to DNA damage. DNA Repair (Amst). 3 (8-9), 1049-1056 (2004).
- Meek, D. W. Tumor suppression by p53: a role for the DNA damage response). Nat. Rev. Cancer. 9 (10), 714-723 (2009).
- Miller, F. R., Medina, D., Heppner, G. H. Preferential growth of mammary tumors in intact mammary fatpads. Cancer Res. 41 (10), 3863-3867 (1981).
- Mueller, B. M., Ruf, W. Requirement for binding of catalytically active factor VIIa in tissue factor-dependent experimental metastasis. J. Clin. Invest. 101 (7), 1372-1378 (1998).
- Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression. Biochim. Biophys. Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J. Pharmacol. Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
- Shay, J. W., Zou, Y., Hiyama, E., Qright, W. E. Telomerase and cancer. Hum. Mol. Genet.. 10 (7), 677-685 (2001).
- Sporn, M. B. The war on cancer. Lancet. 347 (9012), 1377-1381 (1996).
- Tao, K., Fang, M., Alroy, J., Sahagian, G. G. Imagable 4T1 model for the study of late stage breast cancer. BMC. Cancer. 8, 228 (2008).
- Versteeg, H. H., et al. Protease-activated receptor (PAR) 2, but not PAR1, signaling promotes the development of mammary adenocarcinoma in polyoma middle T mice. Cancer Res. 68 (17), 7219-7227 (2008).
- Versteeg, H. H., et al. Inhibition of tissue factor signaling suppresses tumor growth. Blood. 111 (1), 190-199 (2008).
- Wagner, K. U. Models of breast cancer: quo vadis, animal modeling?. Breast Cancer Res. 6 (1), 31-38 (2004).
- Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nat. Rev. Cancer. 5 (8), 591-602 (2005).
