चूहे के स्तन वसा पैड में स्तन कैंसर की कोशिकाओं की orthotopic इंजेक्शन ट्यूमर के विकास का अध्ययन करने के लिए।

Summary

कैंसर ट्यूमर के आसपास के ऊतकों के साथ ही स्थानीय समर्थक और विरोधी भड़काऊ मध्यस्थों से प्रभावित है कि एक जटिल बीमारी है। इसलिए, बल्कि चमड़े के नीचे मॉडल की तुलना में orthotropic इंजेक्शन मॉडल, एक तरह से बेहतर है कि mimics मानव विकृति में कैंसर की प्रगति का अध्ययन करने के लिए उपयोगी हो सकता है।

Abstract

स्तन कैंसर के विकास मॉडल की एक बहुतायत का उपयोग कर चूहों में अध्ययन किया जा सकता है। स्तन कैंसर की कोशिकाओं के आनुवंशिक हेरफेर नए ट्यूमर शामक को खोजने के लिए oncogenic प्रगति या मदद में शामिल प्रोटीन के कार्यों में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। इसके अलावा, अलग जीनोटाइप के साथ चूहों में कैंसर की कोशिकाओं को इंजेक्शन लगाने स्ट्रोमल डिब्बे के महत्व का एक बेहतर समझ प्रदान हो सकता है। कई मॉडल रोग प्रगति के कुछ पहलुओं की जांच के लिए उपयोगी हो सकता है लेकिन पूरे कैंसर प्रक्रिया पुनरावृत्ति नहीं है। इसके विपरीत, स्तन कैंसर की कोशिकाओं को बेहतर चूहों के स्तन वसा पैड को engraftment रोग और उचित स्ट्रोमल डिब्बे की उपस्थिति और इसलिए बेहतर mimics मानव कैंसर रोग के स्थान स्मरण दिलाता है। इस अनुच्छेद में, हम orthotopically चूहों में स्तन कैंसर की कोशिकाओं के प्रत्यारोपण और विश्लेषण करने के ऊतकों को इकट्ठा करने के लिए समझाने के लिए कैसे का वर्णन: 14px; रेखा से ऊंचाई:। 28px; "> ट्यूमर परिवेश और मेटास्टेसिस दूर अंगों में इस मॉडल का उपयोग करना, कैंसर के कई पहलुओं (विकास, एंजियोजिनेसिस, और मेटास्टेसिस) ट्यूमर कोशिकाओं को विकसित करने के लिए एक उचित वातावरण प्रदान करके बस की जांच की जा सकती है।

Introduction

कैंसर सदियों से अधिक के लिए पढ़ाई के अधीन कर दिया गया है कि एक बहुत ही जटिल बीमारी है। स्तन कैंसर सबसे आम कैंसर के प्रकार है; यह महिलाओं में मुख्य रूप से होता है, लेकिन कई मायनों भी पुरुषों के ²⁷ में हो सकता है। बीमारी मुख्य रूप से बदले में शरीर में कोशिकाओं की एक अनंत विकास की ओर जाता है जो नियंत्रण तंत्र शासी कोशिका विभाजन के नुकसान के कारण होता है। ये खराबियां कई तंत्र की वजह से हो सकता है: पहला, स्वस्थ कोशिकाओं को कैंसर की कोशिकाओं को अपने स्वयं के विकास के कारकों बनाने के लिए और इस तरह एक उच्च proliferative दर ¹ प्राप्त वृद्धि कारक रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति में वृद्धि जबकि पैदा करने के क्रम में आसपास की कोशिकाओं से विकास संकेतों की जरूरत है; दूसरा, कैंसर की कोशिकाओं विरोधी प्रफलन संकेतों ^{से 8} कम अतिसंवेदनशील होते हैं; तीसरा, यह भी आवश्यक है शरीर कोशिका मृत्यु में सेल नंबर संतुलन के लिए; हालांकि, कैंसर की कोशिकाओं, क्रमादेशित कोशिका मृत्यु से बच apoptosis के ¹⁴ करार दिया; चौथा, कोशिकाओं कोशिकी matrices के पालन करने के लिएआदेश में जीवित रहने के लिए, लेकिन ट्यूमर कोशिकाओं लगाव की जरूरत के बिना आगे बढ़ने और anoikis ¹⁹ के लिए प्रतिरोध दिखा सकते हैं; पांचवां, टेलोमिरेज के सक्रियण टेलोमेर छोटा करने में गतिरोध उत्पन्न और replicative वार्धक्य ²¹ रोकता है; पिछले नहीं बल्कि कम से कम, बदल आनुवंशिक सामग्री ^15,16 में पिंजरे का बँटवारा परिणामों के बाद डीएनए गुणवत्ता नियंत्रण का लंघन। इस अविनियमित प्रसार में एक भूमिका निभा कि ओंकोजीन या ट्यूमर शामक की पहचान करने के लिए, चूहों में ट्यूमर के विकास के प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण हैं।

प्राथमिक ट्यूमर के विकास को आम तौर पर मौत का मुख्य कारण नहीं है। एक माध्यमिक साइट के लिए प्राथमिक साइट से कैंसर कोशिकाओं के प्रवासन, मेटास्टेसिस में कहा, सबसे कैंसर रोगियों के ²² में मौत का प्रमुख कारण है। मेटास्टेसिस माध्यमिक स्थल पर प्रतिरक्षा हमला, परिस्त्राव और विकास से परहेज है, संचलन के माध्यम से यात्रा, ट्यूमर सेल आक्रमण, intravasation जरूरत पर जोर देता। Mesenchymal संक्रमण (EMT) को उपकला एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया में हैमेटास्टेसिस और metastasizing सेल ¹² के लिए पूर्व आवश्यक वस्तुएँ हैं जो उच्च गतिशीलता और invasiveness के साथ कोशिकाओं, उपज जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल में एक स्विच शामिल है। कैंसर प्रक्रिया कैंसर की कोशिकाओं, stromal कोशिकाओं और समर्थक और विरोधी भड़काऊ कोशिकाओं के बीच पारस्परिक बातचीत सहित विभिन्न कार्यों का एक संयोजन का परिणामी है, कैंसर के लिए इन विट्रो दृष्टिकोण अक्सर कैंसर की प्रक्रिया में पूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान नहीं करता है। इसी तरह, ट्यूमर वाहिका संरचना प्रभावित कैंसर विरोधी उपचार अक्सर इस प्रकार इन विवो के उपयोग के दृष्टिकोण अपरिहार्य है, इन विट्रो में अध्ययन नहीं किया जा सकता।

स्तन कैंसर की प्रगति का अध्ययन करने के लिए, विभिन्न प्रयोगात्मक विधियों का विकास किया गया है। सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया मॉडल चूहों ⁵ में स्तन कैंसर की कोशिकाओं के चमड़े के नीचे इंजेक्शन है। इस प्रयोगात्मक सेटअप में, अन्वेषक इन विट्रो में पसंद का एक सेल लाइन के लिए परिवर्तन की एक विस्तृत रेंज को पेश हो सकता है (यानीupregulation, प्रोटीन की डाउनरेगुलेशन) और त्वचा के नीचे कोशिकाओं इंजेक्षन। इस विधि सरल है और इंजेक्शन प्रक्रिया चूहों पर सर्जरी प्रदर्शन करने के लिए किसी भी आवश्यकता के बिना सरल है, ट्यूमर इंजेक्ट किया जाता है, जिस पर साइट स्तन कैंसर के विकास में हो सकता है स्थानीय स्तन ट्यूमर पर्यावरण और इस माहौल के अभाव का प्रतिनिधित्व नहीं करता है कि मानव विकृति में मनाया कि से अलग है। दूसरे, अनुवांशिक इंजीनियर चूहों में स्तन कैंसर की प्रगति का अध्ययन करने के लिए एक vivo में उपकरण के रूप में अक्सर इस्तेमाल किया जाता है। इस मॉडल में, ओंकोजीन (यानी PyMT, Neu) अभिव्यक्ति सहज स्तन ट्यूमर एस के गठन के लिए अग्रणी एक स्तन के ऊतकों विशिष्ट प्रमोटर द्वारा संचालित किया जाता है। इस प्रयोगात्मक सेटअप समय ³ में ट्यूमर के आकार की जाँच के दौरान ड्रग्स या एंटीबॉडी इंजेक्शन लगाने के द्वारा रोग के उपचार के पहलू का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है। हालांकि, कमी या भी आईएनएस दे सकता है ब्याज की एक जीन में उत्परिवर्तित अन्य माउस उपभेदों के साथ इन चूहों के प्रजननस्तन ट्यूमर के विकास को ²⁴ में विभिन्न प्रोटीन की भूमिका में ights। इस मॉडल का नकारात्मक पक्ष यह ट्यूमर के आकार और संख्या में भिन्नता होने का खतरा है। इसके अलावा, transgene अभिव्यक्ति के स्तर जीनोम में एकीकरण साइट पर निर्भर करता है और एक और ⁴ के लिए एक माउस तनाव से बदल सकते हैं। मानव रोग में, केवल कोशिकाओं के एक subpopulation ओंकोजीन व्यक्त या ट्यूमर शमन का स्तर ²⁶ downregulate जबकि इस मॉडल में, transgene की अभिव्यक्ति उपकला मूल के साथ सभी कोशिकाओं के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। मेटास्टेसिस का अध्ययन करने के लिए, स्तन कैंसर की कोशिकाओं को भी नसों के द्वारा इंजेक्शन जा सकता है ²⁵ (एक मॉडल प्रयोगात्मक मेटास्टेसिस कहा जाता है)। हालांकि, इस दृष्टिकोण केवल आंशिक रूप से मेटास्टैटिक प्रक्रिया का स्मरण दिलाता है; यह ट्यूमर कोशिकाओं पर आक्रमण और intravasate करने के लिए आवश्यकता circumvents, और ट्यूमर कोशिकाओं को आसानी से प्रचलन में मौजूद हैं, जो बिंदु से शुरू होता है।

हमारे काम में, हम एक Orthotopic सुई का उपयोगआयन मॉडल स्तन कैंसर की प्रगति ¹³ में ब्याज की जीन की भागीदारी का अध्ययन करने के लिए। हम मानव स्तन कैंसर की कोशिकाओं में प्रोटीन overexpress और इशारा / SCID गामा (एनएसजी) चूहों के स्तन वसा पैड में उन्हें इंजेक्षन। यह इंजेक्शन सेल लाइन में बहुत तेजी से और विविध आनुवंशिक परिवर्तन, यह विकृतिविज्ञानी प्रासंगिक स्थलों पर मेटास्टेसिस के लिए प्राथमिक ट्यूमर के विकास से स्तन कैंसर की प्रगति की पूरी प्रक्रिया को शामिल किया गया है की अनुमति देता है, और यह भी एक अच्छा प्रयोगात्मक मॉडल प्रदान करता है: इस विधि को कई मायनों में फायदेमंद है रोग का जल्दी या देर चरणों में चिकित्सीय उपचार के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए। इसके अलावा, इस मॉडल का उपयोग कर एक आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों या कोशिकाओं का उपयोग करके रोग प्रगति में कैंसर सेल व्युत्पन्न प्रोटीन बनाम स्ट्रोमल की भूमिका की जांच कर सकते हैं। चमड़े के नीचे इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए आसान कर रहे हैं, Orthotopic मॉडल एक अधिक tumorigenic और अधिक मेटास्टेटिक कैंसर सेल की आबादी को जन्म दे। इस प्रकार, परिणाम चमड़े के नीचे इंजेक्शन के माध्यम से प्राप्त कीझूठी नकारात्मक या ट्यूमर के विकास का अध्ययन करने के Orthotopic मॉडल के उपयोग को प्रोत्साहित करने ^6,17 झूठी सकारात्मक या तो हो सकता है।

Protocol

पशु प्रयोगों लीडेन विश्वविद्यालय के मेडिकल सेंटर (LUMC) के पशु कल्याण समिति द्वारा अनुमोदित किया गया। सेल, उपकरण और चूहे की 1. तैयारी आपरेशन से एक दिन पहले, midline के चौथे निपल से इशारा / SCID गामा (ए?…

Representative Results

"Orthotopic स्तन कैंसर मॉडल" के सफल आवेदन स्तन वसा पैड में कोशिकाओं के समुचित इंजेक्शन पर आधारित है। ऐसी कोशिकाओं या रिसाव की imprecise टीका प्रयोगात्मक रूप में त्रुटियों के ट्यूमर के आकार या एक नियंत्रण बफर <strong…

Discussion

स्तन कैंसर की कोशिकाओं की orthotopic इंजेक्शन कैंसर के विकास के सभी पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल है। चूहों के स्तन वसा पैड में इन कोशिकाओं का प्रत्यारोपण ध्यान से ट्यूमर के विकास में परिवर्…

Materials

Name of material/equipment	Company	Catalog number	Comments/Description
Bouin's solution	Sigma-Aldrich	HT10132	Used for investigating the metastasis on lungs
Formalin solution	Sigma-Aldrich	HT501128	Used to fix the tissues
Matrigel, growth factor reduced	Corning	356230	Cells can be resuspended in matrigel for injection
Mosquito forceps	Fine Science Tools	13008-12	Used for stiching
Angled forceps	Electron microscopy sciences	72991-4c	These make the exposure of mammary fat pad easier
Scissors	B Braun Medicals	BC056R	Used to cut open the mice
Straight forceps	B Braun Medicals	BD025R	This is used to open up the skin to expose mammary fat pad
NOD scid gamma mice	Charles River	005557	Experimental animal used for experiment
MDA-MB-231	Sigma-Aldrich	92020424	Experimental cells used for injections
Oculentum simplex	Teva Pharmachemie		Opthalmic ointment used to prevent drying out of eyes
Betadine	Fischer Scientific	19-898-859	Ionophore, used to disinfect the surgical area
Xylazin/Ketamine	Sigma-Aldrich	X1251, K2753	Use injected anesthesia as 10mg/kg and 100mg/kg body weight respectively
Temgesic	Schering-Plough		Use the painkiller as 0,05-0,1mg/kg body weight
DMEM	Life sciences	11995	For trypsin neutralization,use media with serum(FBS:media 1:10 volume); for injection, use media with no serum
Buffered sodium citrate	Aniara	A12-8480-10	Use the volume ratio as citrate:blood; 1:9