Orthotopic Injeksjon av brystkreft celler inn i Mammary Fat Pad av mus å studere tumorvekst.

Summary

Kreft er en kompleks sykdom som er påvirket av vevet rundt svulsten samt lokale pro- og anti-inflammatoriske mediatorer. Derfor kan ortotropiske innsprøytningsmodeller, i stedet for subkutane modeller være nyttige for å studere kreft progresjon på en måte som bedre etterligner human patologi.

Abstract

Brystkreft vekst kan bli studert i mus ved anvendelse av en mengde av modeller. Genetisk manipulering av brystkreftceller kan gi innsikt i funksjonene til proteiner som er involvert i onkogene progresjon eller hjelp til å oppdage nye kreftdempere. I tillegg, kan injisering av kreftceller i mus med forskjellige genotyper gi en bedre forståelse av betydningen av stromal rommet. Mange modeller kan være nyttig å undersøke visse aspekter av sykdomsprogresjon men ikke rekapitulere hele kreftprosessen. I motsetning til dette, brystkreft celler innpoding til melkefettpute av mus bedre sammenfatter plasseringen av sykdommen, og tilstedeværelsen av den riktige stromal rommet, og derfor bedre etterligner human kreftsykdommer. I denne artikkelen beskriver vi hvordan å implantere brystkreftceller i mus orthotopically og forklare hvordan å samle vev for å analysere: 14px; line-høyde.: 28px; "> svulst miljø og metastaser til fjerne organer Ved hjelp av denne modellen, mange aspekter (vekst, angiogenese og metastasering) av kreft kan bli undersøkt ganske enkelt ved å gi et riktig miljø for kreftceller til å vokse.

Introduction

Kreft er en svært kompleks sykdom som har vært gjenstand for studier i over hundre år. Brystkreft er den vanligste krefttypen; det forekommer hovedsakelig hos kvinner, men kan sporadisk også forekomme hos menn ^27. Sykdommen er hovedsakelig forårsaket av tap av styremekanismen styrende celledeling som i sin tur fører til en uendelig vekst av celler i kroppen. Disse feil kan forårsakes av flere mekanismer: først, friske celler må vekstsignaler fra de omliggende celler for å formere seg, mens kreftceller lage sine egne vekstfaktorer og øke ekspresjon av vekstfaktor-reseptorer for således å oppnå en høyere proliferativ sats ^1; sekund, kreftceller er mindre utsatt for anti-proliferative signaler ^8; for det tredje, for å balansere celletallet i kroppen celledød er også nødvendig; imidlertid kreftceller å unnslippe fra programmert celledød, kalt apoptose ^14; fjerde, cellene holder seg til ekstracellulære matriserfor å overleve, men kreftceller kan vokse uten behov for vedlegg og vise motstand mot anoikis ^19; femte, aktivering av telomerase omgår telomerer forkortes og hindrer replikative senescens ^21; sist men ikke minst, hopper av DNA kvalitetskontroll følgende mitose resulterer i endret genetisk innhold ^15,16. For å identifisere onkogener eller tumor demper som spiller en rolle i dette deregulert spredning, tumor vekstforsøk på mus er avgjørende.

Primær tumorvekst er vanligvis ikke den viktigste årsaken til død. Migrering av kreftceller fra det primære område til et sekundært område, betegnes metastase, er den ledende årsak til død i de fleste kreftpasienter ^22. Metastase innebærer svulst celle invasjon, intravasation, reiser gjennom sirkulasjon, unngå immun angrep, bloduttredelse og vekst på videregående stedet. Epitelial til mesenchymale overgang (EMT) er en viktig prosess imetastasering og innebærer en bryter i genekspresjonsprofiler givende celler med høyere motilitet og invasivitet, som er forutsetninger for metastasizing celle ^12. Som kreftprosessen er resultanten av en kombinasjon av ulike tiltak, inkludert gjensidige interaksjoner mellom kreftceller, stromaceller og pro- og anti-inflammatoriske celler, en in vitro metode for å kreft ofte ikke gir full innsikt i kreftprosessen. Tilsvarende antikreftbehandlinger påvirker tumor vaskulaturen kan ofte ikke bli undersøkt in vitro, og dermed bruken av in vivo tilnærminger er uunngåelig.

Å studere brystkreft progresjon, har ulike eksperimentelle metoder blitt utviklet. Den mest brukte modellen er den subkutane injeksjon av brystkreftceller i mus ^5. I denne eksperimentelle oppsettet, kan undersøkeren innføre en lang rekke endringer i en cellelinje av valg in vitro (dvs.oppregulering, nedregulering av proteiner) og injisere cellene under huden. Selv om denne metoden er enkel og innsprøytningsprosessen er enkel, uten behov for å utføre kirurgi på mus, stedet hvor tumor injiseres ikke representerer den lokale brysttumor miljø og fraværet av dette miljø kan resultere i utvikling av brystkreft som er forskjellig fra den som ble observert i humane patologi. For det andre er genetisk modifiserte mus ofte brukt som en in vivo-redskap for å studere brystkreft progresjon. I denne modellen er onkogen (dvs. PyMT, Neu) ekspresjon drevet av et brystvev spesifikk promotor som fører til dannelsen av spontan brysttumor s. Dette eksperimentelle oppsettet er nyttig å studere behandling side av sykdommen ved å injisere narkotika eller antistoffer mens du sjekker tumorstørrelse i tid ^3. Men avl disse musene med andre musestammer mangelfulle eller mutert i et gen av interesse kan også gi insights inn i rollen til ulike proteiner i bryst tumorvekst ^24. Ulempen med denne modellen er at den er utsatt for variasjon i tumorstørrelse og antall. Videre er nivået av transgen ekspresjon avhenger av integrasjonen området i genomet og kan endre seg fra en til en annen musestamme ^4. I denne modellen, kan ekspresjonen av transgenet bli oppnådd ved alle cellene med epitelisk opprinnelse, mens i human sykdom, bare en subpopulasjon av celler som uttrykker oncogenet eller nedregulere de tumor suppressor nivåer ^26. For å studere metastase, kan brystkreftceller også injiseres intravenøst ​​(en modell betegnet eksperimentell metastase) ^25. Men denne tilnærmingen bare rekapitulerer den metastatisk prosess delvis; den omgår behovet for tumorceller å invadere og intravasate, og starter fra det punkt hvor tumorcellene er lett tilstede i sirkulasjonen.

I vårt arbeid bruker vi en orthotopic injection modell for å studere involvering av gener av interesse i brystkreft progresjon ^13. Vi overuttrykker proteinet i humane brystcancerceller og injisere dem inn i melkefettpute av NOD / SCID-gamma (NSG) mus. Denne metoden er fordelaktig på mange måter: det gir svært raske og diverse genetiske endringer i den injiserte cellelinje, den dekker hele prosessen med brystkreft progresjon fra primærtumorvekst til metastaser ved patologisk relevante nettsteder, og det gir også en god eksperimentell modell for å studere effekten av terapeutiske behandlinger på tidlige eller sene stadier av sykdommen. I tillegg kan ved hjelp av denne modellen en undersøke rollen til stromal versus kreftcelle-avledede proteiner i sykdomsutviklingen ved hjelp av genetisk modifiserte mus eller celler. Selv subkutane injeksjoner er lettere å utføre, ortotopiske modeller gi opphav til en mer tumorigen og mer metastatisk kreft cellepopulasjon. Således resultater oppnådd ved hjelp av subkutan injeksjons kan enten være falsk-negative eller falske positive ^6,17 oppmuntre til bruk av ortotopiske modell for å studere tumorvekst.

Protocol

Dyreforsøk ble godkjent av dyrevelferd komiteen av Leiden University Medical Center (LUMC). 1. Utarbeidelse av celler, Instrumenter og mus En dag før operasjon, barbere NOD / SCID gamma (NSG) mus fra fjerde brystvorten til midtlinjen og veie mus for å kontrollere at alle mus har omtrent sammenlignbare vekter. Autoklav en saks, to pinsett og to rette mygg tang (Figur 1a). På dagen for drift, vaske det menneskelige bryst adenocarcinoma (MDA-M…

Representative Results

Vellykket anvendelse av "ortotopisk brystkreftmodell" er basert på korrekt injeksjon av celler inn i melkefettpute. Eksperimentelle feil som upresis inokulering av celler eller lekkasje kan føre til variasjoner i tumorstørrelse eller fravær av en tumor, som fører til dannelsen av en struktur ser lik en melkefettpute injisert med en kontrollbuffer (figur 2A). Veksten av svulsten er avhengig av arten av det injiserte cellelinjen og generelt, kan observeres gjennom huden hos mus (fig…

Discussion

Ortotopisk injeksjon av brystkreftceller er en kraftig modell for å studere alle aspekter av kreftvekst. Implantasjon av disse cellene i melkefettpute av musene bør omhyggelig utført for å hindre variasjoner i tumorvekst. Viktigst, injisere den samme mengde celler til hver mus er avgjørende. For å gjøre dette, bør man trypsineres cellene strengt uten å påvirke cellenes levedyktighet. Ikke-levedyktige celler bør man se bort fra under celletelling, og reagensene (dvs. trypanblått) som kan hjelpe til ?…

Materials

Name of material/equipment	Company	Catalog number	Comments/Description
Bouin's solution	Sigma-Aldrich	HT10132	Used for investigating the metastasis on lungs
Formalin solution	Sigma-Aldrich	HT501128	Used to fix the tissues
Matrigel, growth factor reduced	Corning	356230	Cells can be resuspended in matrigel for injection
Mosquito forceps	Fine Science Tools	13008-12	Used for stiching
Angled forceps	Electron microscopy sciences	72991-4c	These make the exposure of mammary fat pad easier
Scissors	B Braun Medicals	BC056R	Used to cut open the mice
Straight forceps	B Braun Medicals	BD025R	This is used to open up the skin to expose mammary fat pad
NOD scid gamma mice	Charles River	005557	Experimental animal used for experiment
MDA-MB-231	Sigma-Aldrich	92020424	Experimental cells used for injections
Oculentum simplex	Teva Pharmachemie		Opthalmic ointment used to prevent drying out of eyes
Betadine	Fischer Scientific	19-898-859	Ionophore, used to disinfect the surgical area
Xylazin/Ketamine	Sigma-Aldrich	X1251, K2753	Use injected anesthesia as 10mg/kg and 100mg/kg body weight respectively
Temgesic	Schering-Plough		Use the painkiller as 0,05-0,1mg/kg body weight
DMEM	Life sciences	11995	For trypsin neutralization,use media with serum(FBS:media 1:10 volume); for injection, use media with no serum
Buffered sodium citrate	Aniara	A12-8480-10	Use the volume ratio as citrate:blood; 1:9