포유류의 전체 배아 문화에 적합 쥐 혈청의 제조
Summary
Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.
Abstract
Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.
Introduction
모델 동물의 다양한 분자 및 세포 수준에서 발달 메커니즘을 조사하기 위해 발달 생물학에 사용됩니다. 예를 들어, 양서류와 조류 종은 널리 이러한 태아가 어머니의 외부 개발하기 때문에 태아의 직접 조작에 적합한 클래식 모델 동물로 사용되어왔다. 이 동물과는 달리, 포유류의 태아는 엄마의 자궁에서 성장하고, 이후 단계에서의 성장은 자궁의 기능에 결정적으로 의존한다. 따라서, 직접적 초기 단계에서 마우스 및 래트에서 것과 포유류 배아를 조작하는 통상적 어렵다. 1960 년대에, 데니스 새로운 지속적인 산소 공급 및 열 제어 1 WEC 장치를 사용하여 포유류의 전체 배아 문화 (WEC) 기술을 설립했다. WEC에서, 마우스 및 쥐의 배아는 생체, (즉, 자궁의 이상으로) 증가 할 수 있습니다. WEC 기술은 종종 다양한 Chemic의를 추가하여 기형에 사용되었지만AL은 배양액에 화합물이 기술은 또한 포유 동물 2-4에서 고유 발달 메카니즘을 조사하기 위해 다양한 개발 생물학 연구에서 사용되었다. 예를 들어, WEC는 형광 염료 4.0, 세포 이식 (6) 및 리포 펙션 (7) 및 일렉트로 8-13 통한 유전자 도입을 이용하여 야생형과 돌연변이 등의 배아 세포 라벨링 등의 다른 기술과 결합된다.
최근 자궁 조작에 나중 단계에서 쥐의 배아에서 발달 과정을 분석하는 데 사용되었으며, 일렉트로 기술 14 ~ 16과 결합되어 있습니다. 그러나, 이들 기술은 초기 단계 배아에 DNA 용액의 정확한 로컬 주입을 달성 어려움으로 인해 postimplantation 및 midgestation 배아의 조작에 적합하지 않다. 비록 초기 배아 (에 초음파 유도 세포 이식 및 바이러스 벡터를 주입 즉,, E8.5-E-9.5 마우스의) 자궁 내 이전에 17, 18, 우수한 기술은 높은 성공률로이 실험을 수행하는 데 필요한보고되었습니다. 따라서, 높은 접근성 생체와 WEC는 마우스와 쥐 배아의 조작에 대한 장점이 있습니다.
수컷 쥐에서 준비 즉시 원심 분리 (IC) 쥐의 혈청은 종종 WEC 매체에 사용됩니다. 배아 (쥐 마우스 나 E10.0에서 E8.0 이전 즉,) postimplantation 단계에서 배양하면, 합성 중간 IC 쥐 혈청의 혼합물은 종종 WEC 19을위한 매체로 사용됩니다. 더 현재 대안 미디어가 할 수 없기 때문에 그러나, 중반 임신에서 문화 배아에 (즉., E8.0 12.5 마우스 배아 또는 쥐의 배아에서 E10.0-E14.5에서), 100 %의 혈청 매체로 사용한다 2 일 이상 체외에서 정상적으로 성장하는 배아.
고품질 쥐 혈청의 제조는WEC 실험에서 재현성을 달성하기위한 중요한 단계. 연기를 원심 분리에 비해, IC는 적혈구의 대부분이 이미 피브린 응괴로부터 분리 되었기 때문에 혈청 피브린 응괴를 짜내 수집 될 때 용혈을 줄이는 이점이있다. 용혈성 쥐의 혈청은 래트 및 마우스 배아의 정상적인 성장을 지원하는 데 실패 할 때, 즉시 원심 분리하여 혈청을 준비 지연 원심 분리를 사용하여 제조하는 것이 바람직하다. 우리의 프로토콜이 다른 프로토콜에 비해 두 단계를 추가로 포함 18 ~ 20 (예., 이전에 첫 번째 원심 분리에 얼음에 수집 된 혈액을 저장하고 처음으로 원심 분리 한 후 4 ° C에서 2 시간 동안 수집 된 혈액 샘플을 유지). 전반 단계는 혈병의 형성을 지연시킬 수 있고, 후자의 단계는 락 스퀴즈 피브린 응괴의 응고를 촉진시킨다. 따라서, 우리의 프로토콜은 초보자를 사용할 수 있습니다. 그러나, 재생 채혈하고 혈청단순히 프로토콜 책을 참조하여 정확하게 추출은 19 ~ 21 매우 어렵습니다. 이 비디오 문서에서는, 우리는 수컷 쥐와 원심 분리하여 혈청을 추출의 복부 대동맥에서 채혈을 포함 최적의 IC 쥐 혈청의 준비를위한 우리의 표준 프로토콜을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
WEC 실험 결과의 재현성이 높은 품질의 IC 쥐의 혈청과 정확한 배아 해부 기술 3의 사용에 의존하고 있습니다. 금식은 혈액에있는 포도당의 농도를 표준화 할 필요가 있기 때문에 혈액을 수집하기 전에 금식의 기간을 단축하지 마십시오. 호르몬 수준은 발정주기에 따른 여성 동물에서 변화하기 때문에 암컷 쥐 혈청의 제조에 사용되지 않아야하고, 에스트라 디올과 같은 호르몬 변화는 배아…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Mr. Hajime Ichijo for video recording and helpful advice concerning editing the video. We also thank the Osumi lab members for animal care. This work is supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Area, Neural Diversity and Neocortical Organization, from MEXT of Japan (to N. O.). T. K. was supported by a Research Fellowship of JSPS for Young Scientists.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Isoflurane | Abbott | B506 | For anesthesia of rats. |
| Large scissors | Napox | B-7H | Stelized scissors for cutting the skin and muscle of rats. |
| Curved forceps | Napox | A-3-2 | Stelized forceps for picking up the skin of rats and squeezing the fibrin clot. |
| Sprague-Dawley (SD) rat | Charles Rivers Laboratories | Retired male rats from colony in the lab or purchased retired male rats. | |
| Syringe (20 ml) | TERUMO | SS-29ESZ | |
| Needle (21G x 5/8") | TERUMO | NN-2116R | |
| Sterile test (spitz) tube (10 ml) | ASIAKIZAI | 1101C000B-10 | For collection of boold |
| Sterile disposable pipette | Eiken Chemical | CD2000 No.4 | |
| Sterilie disposable tube (15 ml) | Falcon | 2196 |
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