Подготовка сыворотки крыс Подходит для млекопитающих всей эмбрионов культуры
Summary
Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.
Abstract
Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.
Introduction
Разнообразие модельных животных используются в биологии развития, чтобы исследовать механизмы развития на молекулярном и клеточном уровнях. Например, амфибий и птиц видов были широко использованы в качестве классических модельных животных, которые подходят для прямого манипулирования эмбрионов, потому что эти эмбрионы разрабатывать за пределами матери. В отличие от этих животных, эмбрионов млекопитающих растут в матке матери, и рост на более поздних стадиях в решающей степени зависит от функции матки. Таким образом, это, как правило, трудно непосредственно манипулировать эмбрионов млекопитающих, таких как те, от мышей и крыс на ранних стадиях. В 1960 году Денис Новый создана млекопитающего всю культуру эмбрионов (ВЭС) технологии с использованием WEC аппараты с непрерывной подачи кислорода и теплового контроля 1. В WEC, мыши и крысы эмбрионы могут расти экс естественных, (то есть, за пределами матки). Хотя ВЭС техника часто используется в тератологии, добавив различные химикодр. соединений в культуральной среде, этот метод также был использован в различных биологических исследований развития изучить уникальные механизмы развития у млекопитающих 2-4. Например, ВДК в сочетании с другими методами, такими как маркировки клеток, в эмбрионов дикого типа и мутантных с помощью флуоресцентного красителя 5, трансплантацию клеток 6, и введение генов с помощью липофекции 7 и 8-13 электропорации.
В последнее время в маточно манипуляции были использованы для анализа процессов развития зародышей грызунов на более поздних стадиях и была объединена с методами электропорации 14-16. Однако, эти методы не подходят для манипуляции послеимплантационных и середине беременности эмбрионов из-за трудностей, достигших точную локальную инъекцию раствора ДНК в эмбрионы на ранних стадиях. Хотя трансплантация ультразвуковым контролем клеток и инъекции вирусных векторов в ранних эмбрионов (то есть, Были зарегистрированы E8.5-E-9.5 в мыши) в утробе матери ранее 17,18, отличные навыки, необходимые для выполнения этих экспериментов с высокой вероятностью успеха. Таким образом, ВДК с высокой доступностью экс виво имеет преимущества по отношению к манипуляции мышей и крыс эмбрионов.
Сразу центрифугировали (IC) сыворотки крыс получали из самцов крыс часто используется для ПЭВ среды. Когда эмбрионы культивируют на стадии постимплантационного (т.е. раньше, чем E8.0 у мыши или E10.0 у крыс), смесь синтетической среде и IC крысиной сыворотки часто используется в качестве среды для ВДК 19. Однако, чтобы культуры эмбрионов на середине беременности (то есть., E8.0-12.5 в мышиных эмбрионов или E10.0-E14.5 в крысиных эмбрионов), 100% сывороточного должны использоваться в качестве средства, потому что ни в настоящее время альтернативные СМИ не позволяет эмбрионы для выращивания обычно в пробирке в течение более 2 дней.
Подготовка высококачественной крысиной сыворотки являетсяважным шагом для достижения воспроизводимости в ВЭК экспериментов. По сравнению с задержкой центрифугированием, IC имеет преимущество уменьшения гемолиза, когда сыворотку собирали путем выдавливания фибриновый сгусток, потому что большинство эритроцитов уже отделена от фибринового сгустка. Как гемолитической сыворотки крыс не может поддерживать нормальный рост крыс и мышей эмбрионов, подготовка сыворотке с помощью немедленного центрифугирования предпочтительно с использованием препарата замедленного центрифугирование. Наш протокол содержит два дополнительных шагов по сравнению с другими протоколами 18-20 (т.е.., Хранения собранной крови на льду до первого центрифугирования и поддержание собранные образцы крови в течение 2 часов при 4 ° С после первого центрифугирования). Первый шаг может задержать образование сгустка крови, и последний шаг способствует затвердевание фибринового сгустка для легкого сжатия. Таким образом, наша протокол может быть использован новичками. Однако, воспроизводя сбора крови и сывороткиДобыча точно, просто ссылаясь на протокольных книг чрезвычайно трудно 19-21. В этом видео статье мы демонстрируем нашу стандартный протокол для подготовки оптимального IC крысиной сыворотки, которая включает сбор крови из брюшной аорты самцов крыс и извлечения сыворотке путем центрифугирования.
Protocol
Representative Results
Discussion
Воспроизводимые результаты в ВЭК экспериментов зависят от использования высококачественного IC крысиной сыворотки и точной техники эмбрион рассечение 3. Не сократить период поста перед сбором крови, потому что пост необходимо стандартизировать концентрации глюкозы в крови. Сам…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Mr. Hajime Ichijo for video recording and helpful advice concerning editing the video. We also thank the Osumi lab members for animal care. This work is supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Area, Neural Diversity and Neocortical Organization, from MEXT of Japan (to N. O.). T. K. was supported by a Research Fellowship of JSPS for Young Scientists.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Isoflurane | Abbott | B506 | For anesthesia of rats. |
| Large scissors | Napox | B-7H | Stelized scissors for cutting the skin and muscle of rats. |
| Curved forceps | Napox | A-3-2 | Stelized forceps for picking up the skin of rats and squeezing the fibrin clot. |
| Sprague-Dawley (SD) rat | Charles Rivers Laboratories | Retired male rats from colony in the lab or purchased retired male rats. | |
| Syringe (20 ml) | TERUMO | SS-29ESZ | |
| Needle (21G x 5/8") | TERUMO | NN-2116R | |
| Sterile test (spitz) tube (10 ml) | ASIAKIZAI | 1101C000B-10 | For collection of boold |
| Sterile disposable pipette | Eiken Chemical | CD2000 No.4 | |
| Sterilie disposable tube (15 ml) | Falcon | 2196 |
Riferimenti
- New, D. A. T., Copp, A. J., Cockroft, D. L. Introduction. Mammalian Postimplantation Embryos. A Practical Approach. , 1-14 (1990).
- Eto, K., Takakubo, F. Improved development of rat embryos in culture during the period of craniofacial morphogenesis. J Craniofac Genet Dev Biol. 5, 351-355 (1985).
- Takahashi, M., Osumi, N. The method of rodent whole embryo culture using the rotator-type bottle culture system. J Vis Exp. (42), e2170 (2010).
- New, D. A. Whole embryo culture, teratogenesis, and the estimation of teratologic risk. Teratology. 42, 635-642 (1990).
- Matsuo, T., et al. A mutation in the Pax-6 gene in rat small eye is associated with impaired migration of midbrain crest cells. Nat Genet. 3, 299-304 (1993).
- Nomura, T., Holmberg, J., Frisen, J., Osumi, N. Pax6-dependent boundary defines alignment of migrating olfactory cortex neurons via the repulsive activity of ephrin A5. Development. 133, 1335-1345 (2006).
- Yamamoto, M., et al. Nodal antagonists regulate formation of the anteroposterior axis of the mouse embryo. Nature. 428, 387-392 (2004).
- Inoue, T., et al. Role of cadherins in maintaining the compartment boundary between the cortex and striatum during development. Development. 128, 561-569 (2001).
- Takahashi, M., Osumi, N. Pax6 regulates specification of ventral neurone subtypes in the hindbrain by establishing progenitor domains. Development. 129, 1327-1338 (2002).
- Calegari, F., Haubensak, W., Yang, D., Huttner, W. B., Buchholz, F. Tissue-specific RNA interference in postimplantation mouse embryos with endoribonuclease-prepared short interfering RNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14236-14240 (2002).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Dev Growth Differ. 50, 485-497 (2008).
- Pryor, S. E., Massa, V., Savery, D., Greene, N. D., Copp, A. J. Convergent extension analysis in mouse whole embryo culture. Methods Mol Biol. 839, 133-146 (2012).
- Kikkawa, T., et al. Dmrta1 regulates proneural gene expression downstream of Pax6 in the mammalian telencephalon. Genes Cells. 18, 636-649 (2013).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscienze. 103, 865-872 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
- Turnbull, D. H. Ultrasound backscatter microscopy of mouse embryos. Methods Mol Biol. 135, 235-243 (2000).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5. J Vis Exp. (45), e2047 (2010).
- Quinlan, G. A., Khoo, P. L., Wong, N., Trainor, P. A., Tam, P. P. Cell grafting and labeling in postimplantation mouse embryos. Methods Mol Biol. 461, 47-70 (2008).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vinterstein, K., Behringer, R., Nagy, A., Gertsenstein, M., Vinterstein, K., Behringer, R. Roller culture of postimplantation embryos. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , 237-241 (2003).
- Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Preparation of rat serum for culturing mouse embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 391-393 (2011).
- Brown-Woodman, P. D., Ritchie, H. E., Korabelnikoff, A., Emmanuel, C. Replacement of ether with alternate volatile anesthetics for collection of rat serum used in embryo culture. Toxicol In Vitro. 18, 719-724 (2004).
- Gray, J., Ross, M. E. Neural tube closure in mouse whole embryo culture. J Vis Exp. (56), e3132 (2011).
- Machado, C. B., et al. Reconstruction of phrenic neuron identity in embryonic stem cell-derived motor neurons. Development. 141, 784-794 (2014).
- Glanville-Jones, H. C., Woo, N., Arkell, R. M. Successful whole embryo culture with commercially available reagents. Int J Dev Biol. 57, 61-67 (2013).
- Ornoy, A., Yacobi, S., Yaffee, P. A simple method of culture of 11.5-day-old rat embryos in DMEM/F12 and 20% fetal bovine serum. J Anat. 203, 419-423 (2003).
- Moore-Scott, B. A., Gordon, J., Blackburn, C. C., Condie, B. G., Manley, N. R. New serum-free in vitro culture technique for midgestation mouse embryos. Genesis. 35, 164-168 (2003).
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System. J Vis Exp. (85), e50308 (2014).
