Beredning av Rat Serum Passar Mammalian Hela Embryo Culture
Summary
Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.
Abstract
Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.
Introduction
En mängd olika modelldjur används i utvecklingsbiologi för att undersöka utvecklings mekanismer på molekylär och cellulär nivå. Till exempel har amfibie-och fågelarter stor utsträckning använts som klassiska modelldjur som är lämpliga för direkt manipulation av embryon, därför att dessa embryon utvecklas utanför modern. Till skillnad från dessa djur, embryon från däggdjur växer i livmodern hos modern, och tillväxt i senare skeden är synnerligen beroende på funktionen av livmodern. Därför är det ofta svårt att direkt manipulera embryon från däggdjur som de från mus och råtta i tidiga skeden. På 1960-talet, Denis Ny etablerat ett däggdjur hel embryo kultur (WEC) teknik med hjälp av WEC apparater med en kontinuerlig syrgastillförsel och värmekontroll 1. I WEC kan mus-och råttembryon växer ex vivo (dvs. utanför livmodern). Även WEC teknik användes ofta i teratologi genom att lägga till olika kemikalier och kemiskaAl-föreningar i odlingsmediet, denna teknik har också använts i olika utvecklingsbiologiska studier för att undersöka unika utvecklingsmekanismer i däggdjur 2-4. Till exempel är WEC kombineras med andra tekniker, såsom cell-märkningen, i vild typ och mutanta embryon genom att använda fluorescerande färgämnet 5, celltransplantation 6 och genintroduktion via lipofektion 7 och elektroporering 8-13.
Nyligen, i livmodern manipulation har använts för att analysera utvecklingsprocesser i gnagare embryon i senare skeden och har kombinerats med elektroporation tekniker 14-16. Men dessa tekniker är inte lämpliga för manipulering av implantationen och midgestation embryon på grund av svårigheter att uppnå korrekt lokal injektion av DNA-lösningen i embryon i ett tidigt skede. Även ultraljud-styrda celltransplantation och injektion av virala vektorer i tidiga embryon (dvs., E8.5-E-9.5 i musen) i livmodern har rapporterats tidigare 17,18, är utmärkta kunskaper som krävs för att utföra dessa experiment med ett bra resultat. Därför WEC med hög tillgänglighet ex vivo har fördelar med avseende på hantering av mus-och råttembryon.
Omedelbart centrifuger (IC) råttserum bereddes från hanråttor används ofta för WEC medium. När embryon odlas vid implantationen skede (dvs tidigare än E8.0 i mus eller E10.0 i råtta), är en blandning av syntetiskt medium och IC råttserum ofta används som ett medium för WEC 19. Men att odla embryon vid mitten av dräktigheten (dvs.., E8.0-12.5 i musembryon eller E10.0-E14.5 i råttembryon), 100% serum bör användas som ett medium för att ingen för närvarande tillgänglig alternativa medier tillåter embryon att växa normalt in vitro under mer än 2 dagar.
Beredningen av högkvalitativa råttserum ärett avgörande steg för att uppnå reproducerbarhet i WEC experiment. Jämfört med fördröjd centrifugering, har IC den fördelen att minska hemolys när serumet uppsamlas genom att klämma fibrinkoagel eftersom de flesta av de röda blodkropparna har redan separerats från fibrinkoagel. Som hemolytisk råttserum inte stödja den normala tillväxten av råtta och mus embryon, är framställningen av serum med hjälp av omedelbar centrifugering att föredra framför beredning med hjälp av försenad centrifugering. Vår protokoll innehåller två ytterligare steg jämfört med andra protokoll 18-20 (dvs.., Lagra det uppsamlade blodet på is före den första centrifugeringen och upprätthålla de uppsamlade blodproven för 2 timmar vid 4 ° C efter den första centrifugeringen). Den förra steget kan fördröja bildningen av blodproppen, och den senare steg främjar stelnande av fibrinkoagel för enkel klämma. Därför kan våra protokoll kan användas av nybörjare. Men återge blodinsamling och serumutvinning noggrant genom att helt enkelt hänvisa till protokoll böcker är oerhört svårt 19-21. I denna video artikeln visar vi vårt standardprotokoll för beredning av optimal IC råttserum, vilket inkluderar insamling blod från bukaorta hos hanråttor och utvinning av serumet genom centrifugering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Reproducerbara resultat i WEC experiment är beroende av användningen av högkvalitativa IC råttserum och korrekt embryo dissektion teknik 3. Inte förkorta perioden av fasta innan samla blod eftersom fastan är nödvändigt att standardisera glukoskoncentrationer i blodet. Honråttor bör inte användas för framställning av serum eftersom hormonnivåerna förändras på hondjur enligt estrous cykeln, och sådana förändringar i estradiol hormoner är olämpliga för embryokulturer. Dessutom bör extremt…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Mr. Hajime Ichijo for video recording and helpful advice concerning editing the video. We also thank the Osumi lab members for animal care. This work is supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Area, Neural Diversity and Neocortical Organization, from MEXT of Japan (to N. O.). T. K. was supported by a Research Fellowship of JSPS for Young Scientists.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Isoflurane | Abbott | B506 | For anesthesia of rats. |
| Large scissors | Napox | B-7H | Stelized scissors for cutting the skin and muscle of rats. |
| Curved forceps | Napox | A-3-2 | Stelized forceps for picking up the skin of rats and squeezing the fibrin clot. |
| Sprague-Dawley (SD) rat | Charles Rivers Laboratories | Retired male rats from colony in the lab or purchased retired male rats. | |
| Syringe (20 ml) | TERUMO | SS-29ESZ | |
| Needle (21G x 5/8") | TERUMO | NN-2116R | |
| Sterile test (spitz) tube (10 ml) | ASIAKIZAI | 1101C000B-10 | For collection of boold |
| Sterile disposable pipette | Eiken Chemical | CD2000 No.4 | |
| Sterilie disposable tube (15 ml) | Falcon | 2196 |
Riferimenti
- New, D. A. T., Copp, A. J., Cockroft, D. L. Introduction. Mammalian Postimplantation Embryos. A Practical Approach. , 1-14 (1990).
- Eto, K., Takakubo, F. Improved development of rat embryos in culture during the period of craniofacial morphogenesis. J Craniofac Genet Dev Biol. 5, 351-355 (1985).
- Takahashi, M., Osumi, N. The method of rodent whole embryo culture using the rotator-type bottle culture system. J Vis Exp. (42), e2170 (2010).
- New, D. A. Whole embryo culture, teratogenesis, and the estimation of teratologic risk. Teratology. 42, 635-642 (1990).
- Matsuo, T., et al. A mutation in the Pax-6 gene in rat small eye is associated with impaired migration of midbrain crest cells. Nat Genet. 3, 299-304 (1993).
- Nomura, T., Holmberg, J., Frisen, J., Osumi, N. Pax6-dependent boundary defines alignment of migrating olfactory cortex neurons via the repulsive activity of ephrin A5. Development. 133, 1335-1345 (2006).
- Yamamoto, M., et al. Nodal antagonists regulate formation of the anteroposterior axis of the mouse embryo. Nature. 428, 387-392 (2004).
- Inoue, T., et al. Role of cadherins in maintaining the compartment boundary between the cortex and striatum during development. Development. 128, 561-569 (2001).
- Takahashi, M., Osumi, N. Pax6 regulates specification of ventral neurone subtypes in the hindbrain by establishing progenitor domains. Development. 129, 1327-1338 (2002).
- Calegari, F., Haubensak, W., Yang, D., Huttner, W. B., Buchholz, F. Tissue-specific RNA interference in postimplantation mouse embryos with endoribonuclease-prepared short interfering RNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14236-14240 (2002).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Dev Growth Differ. 50, 485-497 (2008).
- Pryor, S. E., Massa, V., Savery, D., Greene, N. D., Copp, A. J. Convergent extension analysis in mouse whole embryo culture. Methods Mol Biol. 839, 133-146 (2012).
- Kikkawa, T., et al. Dmrta1 regulates proneural gene expression downstream of Pax6 in the mammalian telencephalon. Genes Cells. 18, 636-649 (2013).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscienze. 103, 865-872 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
- Turnbull, D. H. Ultrasound backscatter microscopy of mouse embryos. Methods Mol Biol. 135, 235-243 (2000).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5. J Vis Exp. (45), e2047 (2010).
- Quinlan, G. A., Khoo, P. L., Wong, N., Trainor, P. A., Tam, P. P. Cell grafting and labeling in postimplantation mouse embryos. Methods Mol Biol. 461, 47-70 (2008).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vinterstein, K., Behringer, R., Nagy, A., Gertsenstein, M., Vinterstein, K., Behringer, R. Roller culture of postimplantation embryos. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , 237-241 (2003).
- Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Preparation of rat serum for culturing mouse embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 391-393 (2011).
- Brown-Woodman, P. D., Ritchie, H. E., Korabelnikoff, A., Emmanuel, C. Replacement of ether with alternate volatile anesthetics for collection of rat serum used in embryo culture. Toxicol In Vitro. 18, 719-724 (2004).
- Gray, J., Ross, M. E. Neural tube closure in mouse whole embryo culture. J Vis Exp. (56), e3132 (2011).
- Machado, C. B., et al. Reconstruction of phrenic neuron identity in embryonic stem cell-derived motor neurons. Development. 141, 784-794 (2014).
- Glanville-Jones, H. C., Woo, N., Arkell, R. M. Successful whole embryo culture with commercially available reagents. Int J Dev Biol. 57, 61-67 (2013).
- Ornoy, A., Yacobi, S., Yaffee, P. A simple method of culture of 11.5-day-old rat embryos in DMEM/F12 and 20% fetal bovine serum. J Anat. 203, 419-423 (2003).
- Moore-Scott, B. A., Gordon, J., Blackburn, C. C., Condie, B. G., Manley, N. R. New serum-free in vitro culture technique for midgestation mouse embryos. Genesis. 35, 164-168 (2003).
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System. J Vis Exp. (85), e50308 (2014).
