Gebruik te maken van op maat ontworpen galvanotaxis Chambers naar Study Directional Migratie van Prostaat Cellen

Summary

We present a method to apply a physiological electric field to migrating, immortalized prostate cells in a custom-made galvanotaxis chamber. Using this method, we demonstrate that 2 lines of non-tumorigenic prostate cells demonstrate different degrees of migration directionality in the field.

Abstract

De fysiologische elektrisch veld wordt voor specifieke biologische functies, zoals het leiding celmigratie in embryonale ontwikkeling, neuronale uitgroei en epitheliale wondgenezing. Het toepassen van een gelijkstroom elektrisch veld gekweekte cellen in vitro induceert directionele celmigratie of galvanotaxis. De 2-dimensionale galvanotaxis methode die wij hier demonstreren gemodificeerd met op maat gemaakte poly (vinylchloride) (PVC) Chambers, glas, platina elektroden en het gebruik van een gemotoriseerde podium waarop de cellen worden afgebeeld. De PVC-kamers en platina elektroden vertonen een lage cytotoxiciteit en zijn betaalbaar en herbruikbaar. Het glasoppervlak en het gemotoriseerde microscooptafel verbeteren beeldkwaliteit en laat mogelijke wijzigingen op het glasoppervlak en behandelingen aan de cellen. We filmden de galvanotaxis van twee niet-tumorigene, SV40 vereeuwigd prostaat cellijnen, PRN-1-1 en PNT2. Deze twee cellijnen vertonen gelijkaardige migratie snelheden en beide migreren naarde kathode, maar ze vertonen een verschillende mate van gerichtheid in galvanotaxis. De verkregen via dit protocol resultaten suggereren dat de PRN-1-1 en de PNT2 cellijnen verschillende intrinsieke eigenschappen die hun directionele trekkende reacties regeren kan hebben.

Introduction

Endogene elektrische velden worden gedetecteerd in verschillende weefsels, zoals huid ^{1, 32, 33} en hersenen ^2. De fysiologische elektrisch veld wordt voor specifieke biologische functies, waaronder aansturen embryo ontwikkeling ^{3, 4,} geleiden de uitgroei van neuronale uitlopers ^{5, 6} en bevorderen epitheel en corneale wonden ^{1, 7.} In vitro toepassing van een gelijkstroom elektrisch veld gekweekte cellen bootst de fysiologische elektrisch veld en induceert celmigratie directionele of galvanotaxis. Galvanotaxis is onderzocht in fibroblasten ^8, vissen keratinocyten ^9, menselijk epitheel en hoornvlies keratinocyten ^10-12, lymfocyten ¹³ neuroblasts ² en neuronale progenitorcellen ^14. Bij blootstelling aan het aangelegde veld, de meeste onderzochte cellen migreren directioneel naar de kathodische (-) pool. Maar verschillende kankercellen, waaronder zeer metastatischehumane borstkankercellen en de humane prostaatkanker cellijn PC-3M, naar de anodische (+) pool ^{15, 16.} verschillende mechanismen voorgesteld galvanotaxis bemiddelen of het vermogen van de cellen om het elektrisch veld detecteren, inclusief activatie verklaren van EGF receptoren ^12, de epitheliale natriumkanaal ¹⁷ PI3K en PTEN ¹⁸ en vrijgave van calciumionen ^{15, 19.} Het mechanisme is nog niet volledig begrepen en het is mogelijk dat meerdere signaalroutes betrokken bij galvanotaxis.

De 2-dimensionale galvanotaxis methode die wij hier demonstreren nuttig is de gerichte migratie van hechtende, beweeglijke cellen te karakteriseren, op individuele celmigratie ^{10, 12, 17} of migratie van een vel van confluente cellen ^{18, 20.} Deze techniek is aangepast van toezicht Peng en Jaffe ^21, en ​​Nishimura et al. ¹⁰ met op maat gemaakte, heldere PVC kamers, met afneembare coverslips zorgen voor gemakkelijke cel ophalen na galvanotaxis voor secundaire analyse, zoals immuno-fluorescentie beeldvorming. Het glasoppervlak van de galvanotaxis kamers is optisch-compatibel, die het filmen bij een hoge vergrotingsfactor en met fluorescent-gelabelde cellen mogelijk maakt. Ook kan proefopzet met modificatie van het glasoppervlak, zoals het veranderen van de oppervlaktelaag of kosten. Afstandhouders van No. 1 dekglaasje worden in de kamers om de stroom over de cellen te minimaliseren; daarom jouleverwarming, dat evenredig is met het kwadraat van de stroom, zou de cellen oververhitten tijdens het experiment. De verbindende agar bruggen voorkomen direct contact van de elektroden met de cellen en verandering van het medium pH of de ionenconcentratie in galvanotaxis voorkomen.

Twee niet-tumorigene humane prostaat cellijnen onderzocht op hun galvanotaxis reactie in deze studie. De PRN-1-1 ²² en PNT2 ²³ zijn beide SV40-geïmmortaliseerde, growth factor-afhankelijke cellijnen die de epitheliale merkers cytokeratine 5, 8, 18 en 19 met weinig of geen expressie van het prostaat-specifiek antigeen (PSA). Beide cellijnen houden de veelhoekige morfologie van normale epitheelcellen, maar chromosomale abnormaliteit werd waargenomen bij karyotypering ^{22, 24.} Hoewel PRN-1-1 en PNT2 hebben dezelfde gedrag bij de meeste experimenten, ze vertonen verschillen in de vorming van acinaire structuur en galvanotaxis. Bij een 3-D matrix Matrigel, de PRN-1-1 cellen vormen holle acinaire structuren lumen lijken de normale prostaat weefsel ^25. De PNT2 cellen vormen vaste bolletjes zonder lumen of gepolariseerde epitheel ^26. De PRN-1-1 cellen ook een hogere galvanotactic respons dan de PNT2 in de huidige studie tonen. De correlatie tussen de vorming van acinar structuur en galvanotaxis in PRNS-1-1 suggereert dat de galvanotactic signalen een rol kunnen spelen bij het organiseren van de prostate klier bewegingen weefsel in reactie op endogene elektrische velden, en verschaft verder kenmerken onderscheid tussen deze 2 cellijnen.

Protocol

1. Het kweken Prostaat Cellen Cultuur de PRN-1-1 en PNT2 prostaatcellen op 100 mm kweekschalen in RPMI 1640 medium aangevuld met 10% FBS en antibiotica Antimycoticum bij 37 ° C met 5% CO2. Vernieuw de kweekmedium elke dag tot de cellen te bereiken 80% samenvloeiing van de galvanotaxis experimenten. 2. Montage galvanotaxis Chambers Assembleren bodem Chambers Veeg een plastic galvanotaxis kamer met 2-propanol. Breng de zeewaardig siliconen afdic…

Representative Results

Twee lijnen van prostaatcellen (PRN-1-1 en PNT2) werden onderzocht met deze methode. Cellen in beide lijnen migreren vergelijkbare snelheden van 1,0 +/- 0,3 micron / min in de loop van 2 uur (Figuur 5A). Echter, de gerichtheid op het elektrische veld is 0,7 +/- 0,3 voor de PRN-1-1 lijn, en 0,2 +/- 0,8 voor de PNT2 lijn (Figuur 5B). De resultaten tonen een significant verschil in de galvanotaxis van deze twee cellijnen (p <0,01, 100 cellen werden gevolgd), wat suggereert dat ze versch…

Discussion

De analyse van galvanotaxis reactie van een cel is een belangrijke functionele indicator voor vele cellulaire trekkende of groeiprocessen ^{27, 28.} Hier gebruiken we een op maat gemaakte kamer met glazen oppervlak tot twee prostaat cellijnen te filmen. Deze cellijnen toonden verschillende graden van galvanotaxis en we speculeren dat de intracellulaire lokalisatie of de activering van de galvanotaxis bemiddelende eiwitten gedurende het proces van het genereren van de onsterfelijke cellijnen, waardoor het waargen…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Cells
pRNS-1-1 prostate cells			Lee et. al., (1994)
PNT2 prostate cells	Sigma-Aldrich	95012613-1VL	Berthon et al., (1995)
Medium and solutions
RPMI 1640 medium	Invitrogen	11875-093	warm up to 37°C before use
Fetal Bovine Serum – Premium	Atlanta Biologicals	S11150	10% in PBS, warm up to 37°C before use
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Life Technologies	15240	add 5mL to 500mL medium
2-propanol	VWR	BDH1133-5GL
PBS	–	–	137mM NaCl, 2.7mM KCl, 4.3mM Na2HPO4 and 1.5mM KH2PO4 in 1000mL of H2O, pH to 7.4 and autoclaved, warm up to 37°C before use
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-056	warm up to 37°C before use, treat cells for 3-5 min at 37°C
Galvanotaxis device
Galvanotaxis chambers	Precision Plastics Inc, CA		custom-designed (1/4" X 2" X 3.5"), non-toxic, clear PVC chambers
Galvanotaxis electrodes	UCD electric shop		platinum coiled electrodes with flexable cords
Galvanotaxis power box	Substrate Engineering, CA		custom-designed DC power output with voltmeter
Microscope Cover Glass, Large, 45X50mm-No. 1.5	Fisher	12-544-F
Microscope Cover Glass, small, 25X25mm, No. 1	ThermoScientific	3307
Diamond point marker	ThermoScientific	750
Marine grade silicon sealer, clear	3M	051135-08019
High vacuum grease	Dow Corning	2021846-0807
6mL syringe	Fisher Scientific	05-561-64
Nichiryo Syringe, 1.5mL	Nichiryo	SG-M
Cotton applicators	Purtian Medical Products	806-WC
Qtips	Johnson & Johnson	729389
Nalgene 180 PVC tubing	Nalgene	8000-9030	503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall
Bacto-Agar	Difco	0140-01	make 2% agar solution
Razor Blade	Personna	74-0001
Equipments and Software
Benchtop Centrifuge	Eppendorf	5810R	operated with an A-4-62 rotor
Cellometer Auto T4	Nexcelom	Auto T4
Cellometer counting chambers	Nexcelom	CHT4-SD100-002	load 20uL cell solutions to count
Culture Temp Warming plate	Bel-Art Scienceware	370150000	to keep the galvanotaxis chambers at 37°C
Eclipse TE-2000 microscope with motorized stage and environmental chamber	Nikon
Plan Fluor 10X/0.30 objective len	Nikon
Retiga EX CCD camera	Qimaging		Cooled CCD camara, mono-color, 12-bit
Compressed air with 5% CO2	Airgas		special order
Volocity 6.3	PerkinElmer		Image acquiring software
Improvision OpenLab 5.5.2	PerkinElmer		Cell tracking software and customized to measure migration angles
FileMaker Pro Advanced, 8.0	FileMaker
Microsoft Excel 2008 for Mac	Microsoft