We present a method to apply a physiological electric field to migrating, immortalized prostate cells in a custom-made galvanotaxis chamber. Using this method, we demonstrate that 2 lines of non-tumorigenic prostate cells demonstrate different degrees of migration directionality in the field.
Den fysiologiske elektriske feltet serverer spesifikke biologiske funksjoner, som for eksempel å dirigere celle migrasjon i embryo utvikling, nevronale utvekst og epitel sårtilheling. Påføring av en likestrøm elektrisk felt til dyrkede celler in vitro induserer retningscellemigrering eller galvanotaxis. Den to-dimensjonale galvanotaxis metode demonstrerer vi her er modifisert med skreddersydd poly (vinylklorid) (PVC) kammer, glassoverflaten, platinaelektroder, og bruk av en motorisert stadium hvor cellene er avbildet. PVC kamre og platina elektroder viser lav cytotoksisitet og er rimelig og re-brukbar. Glassoverflaten og den motoriserte objektbord forbedre kvaliteten av bildene og tillate mulige modifikasjoner av glassoverflaten og behandlinger til cellene. Vi filmet galvanotaxis av to ikke-tumorigene, SV40-udødelig prostata cellelinjer, pRNS-1-1 og PNT2. Disse to cellelinjer viser lignende migrasjons hastigheter og begge migrere motkatoden, men de viser en annen grad av retnings i galvanotaxis. Resultatene oppnådd via denne protokollen resultatene tyder på at pRNS-1-1 og PNT2 cellelinjer kan ha ulike iboende egenskaper som styrer sine retnings trekkende svar.
Endogene elektriske felt blir detektert i forskjellige vev, slik som hud 1, 32, 33 og hjerne 2. Den fysiologiske elektriske felt tjener spesifikke biologiske funksjoner, inkludert dirigere embryoutvikling 3, 4, føring av utvekst av neuronal prosesser 5, 6 og fremme epitelial og hornhinnen til lukking av sår 1, 7. In vitro anvendelse av et likestrøms elektrisk felt til dyrkede celler ligner den fysiologiske elektrisk felt og induserer retningscellemigrasjon, eller galvanotaxis. Galvanotaxis har blitt studert i fibroblaster 8, fisk keratinocytter 9, menneskelig epitel og hornhinnen keratinocytter 10-12, lymfocytter 13, neuroblasts to, og nevrale stamceller 14. Når de utsettes for den påtrykte felt, de fleste undersøkte celler migrerer retnings mot katodisk (-) pol. Likevel, flere kreftceller, inkludert svært metastatiskhumane brystcancer-celler og den humane prostatacancercellelinje PC-3M, går til anodisk (+) pol 15, 16. Flere mekanismer er foreslått å mediere galvanotaxis eller for å forklare evnen til cellene for å avføle det elektriske felt, inkludert aktivering av EGF-reseptorer 12, epithelial natriumkanal 17, PI3K og PTEN 18, og frigjøring av kalsiumioner 15, 19. Mekanismen er ennå ikke fullt ut forstått, og det er mulig at flere signalveier er involvert i galvanotaxis.
Den to-dimensjonale galvanotaxis metode demonstrerer vi her er nyttig for å karakterisere retnings migrasjon av fastsittende, bevegelige celler, enten for å overvåke enkeltcellemigrering 10, 12, 17 eller migrering av en plate av konfluente celler 18, 20. Denne teknikken er modifisert fra Peng og Jaffe 21, og Nishimura et al. 10 med skreddersydde, klare PVC kamre, med avtagbart coverslips muliggjør enkel celle gjenfinning etter galvanotaxis for sekundær analyse, for eksempel immuno-fluorescens bildebehandling. Glassoverflaten av galvanotaxis kamrene er optisk-kompatibel, noe som gjør det mulig for filming ved høy forstørrelse og med fluoresceinmerkede celler. Den gjør også eksperimentell design med modifisering av glassoverflaten, for eksempel endring av overflatebelegg eller avgifter. Avstandsstykker laget av No. en dekkglass brukes i kamrene for å redusere strømflyten over cellene; derfor joule-varme, som er proporsjonal med kvadratet av strømmen som føres, ikke ville bli overopphetet cellene i løpet av eksperimentet. Forbindelses agar broer forhindre direkte kontakt av elektroder med cellene og hindre endring av pH i mediet eller ion konsentrasjon under galvanotaxis.
To ikke-tumorigene humane prostatacellelinjer ble undersøkt for sin respons galvanotaxis i denne studien. De pRNS-1-1 22 og PNT2 23 er både SV40-udødeliggjort, vekstfaktoravhengige cellelinjer som uttrykker de epiteliale markører cytokeratin 5, 8, 18 og 19 med lav eller ingen ekspresjon av prostata spesifikt antigen (PSA). Begge cellelinjer opprettholde polygonal morfologi av normale epitelceller, men kromosom abnormalitet ble observert i karyotypering 22, 24. Selv pRNS-1-1 og PNT2 dele lignende adferd i de fleste eksperimenter, de viser forskjeller i dannelsen av acinar struktur og i galvanotaxis. På en 3-D matrise, Matrigel, de pRNS-1-1 cellene danner hul acinar strukturer med lumen likner den normale vevet prostatakjertelen 25. Imidlertid PNT2 cellene danne faste kuler uten hulrom eller polarisert epitel 26. De pRNS-1-1 celler også demonstrere en høyere galvanotactic respons enn PNT2 i den aktuelle studien. Korrelasjonen mellom dannelsen av acinar struktur og galvanotaxis i pRNS-1-1 tyder på at de galvanotactic signaler kan spille en rolle i organiseringen av prostate kjertel vev bevegelser i respons til endogene elektriske felt, og gir ytterligere egenskaper for å diskriminere mellom disse to cellelinjer.
Analysen av en celles galvanotaxis responsen har vært en viktig funksjonell indikator for mange mobil trekkfugl eller vekstprosesser 27, 28. Her bruker vi en skreddersydd kammer med glassoverflate for å filme to prostata cellelinjer. Disse cellelinjene viste forskjellige grader av galvanotaxis, og vi spekulerer i at den intracellulære lokalisering eller aktivering av galvanotaxis-medierende proteiner kan bli forstyrret i løpet av prosessen med å generere de udødelige cellelinjer, noe som resulterer i de…
The authors have nothing to disclose.
De prostata cellelinjer er vennlig levert av Dr. Ling-Yu Wang og Dr. Hsing-Jien Kung ved Cancer Center, UC Davis. Dette prosjektet er støttet av NIH galvanotaxis stipend 4R33AI080604.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Cells | |||
pRNS-1-1 prostate cells | Lee et. al., (1994) | ||
PNT2 prostate cells | Sigma-Aldrich | 95012613-1VL | Berthon et al., (1995) |
Medium and solutions | |||
RPMI 1640 medium | Invitrogen | 11875-093 | warm up to 37°C before use |
Fetal Bovine Serum – Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | 10% in PBS, warm up to 37°C before use |
Antibiotic-Antimycotic (100x) | Life Technologies | 15240 | add 5mL to 500mL medium |
2-propanol | VWR | BDH1133-5GL | |
PBS | – | – | 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 4.3mM Na2HPO4 and 1.5mM KH2PO4 in 1000mL of H2O, pH to 7.4 and autoclaved, warm up to 37°C before use |
0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | warm up to 37°C before use, treat cells for 3-5 min at 37°C |
Galvanotaxis device | |||
Galvanotaxis chambers | Precision Plastics Inc, CA | custom-designed (1/4" X 2" X 3.5"), non-toxic, clear PVC chambers | |
Galvanotaxis electrodes | UCD electric shop | platinum coiled electrodes with flexable cords | |
Galvanotaxis power box | Substrate Engineering, CA | custom-designed DC power output with voltmeter | |
Microscope Cover Glass, Large, 45X50mm-No. 1.5 | Fisher | 12-544-F | |
Microscope Cover Glass, small, 25X25mm, No. 1 | ThermoScientific | 3307 | |
Diamond point marker | ThermoScientific | 750 | |
Marine grade silicon sealer, clear | 3M | 051135-08019 | |
High vacuum grease | Dow Corning | 2021846-0807 | |
6mL syringe | Fisher Scientific | 05-561-64 | |
Nichiryo Syringe, 1.5mL | Nichiryo | SG-M | |
Cotton applicators | Purtian Medical Products | 806-WC | |
Qtips | Johnson & Johnson | 729389 | |
Nalgene 180 PVC tubing | Nalgene | 8000-9030 | 503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall |
Bacto-Agar | Difco | 0140-01 | make 2% agar solution |
Razor Blade | Personna | 74-0001 | |
Equipments and Software | |||
Benchtop Centrifuge | Eppendorf | 5810R | operated with an A-4-62 rotor |
Cellometer Auto T4 | Nexcelom | Auto T4 | |
Cellometer counting chambers | Nexcelom | CHT4-SD100-002 | load 20uL cell solutions to count |
Culture Temp Warming plate | Bel-Art Scienceware | 370150000 | to keep the galvanotaxis chambers at 37°C |
Eclipse TE-2000 microscope with motorized stage and environmental chamber | Nikon | ||
Plan Fluor 10X/0.30 objective len | Nikon | ||
Retiga EX CCD camera | Qimaging | Cooled CCD camara, mono-color, 12-bit | |
Compressed air with 5% CO2 | Airgas | special order | |
Volocity 6.3 | PerkinElmer | Image acquiring software | |
Improvision OpenLab 5.5.2 | PerkinElmer | Cell tracking software and customized to measure migration angles | |
FileMaker Pro Advanced, 8.0 | FileMaker | ||
Microsoft Excel 2008 for Mac | Microsoft |