Индукция белка Удаление Через<em> В утробе матери</em> Электропорация Определить дефицит в миграции нейронов в трансгенных моделей
Summary
Neuron migration is regulated by numerous cell autonomous and non-cell autonomous factors. This protocol shows how in utero electroporation can be used to determine whether a phenotype in a transgenic mouse is due to disruption of a cell intrinsic mechanism or impairment of interaction between the neuron and its environment.
Abstract
Генетическая удаление с помощью системы Cre-LOX в трансгенных линий мышей является мощным инструментом, используемым для изучения функции белка. Тем не менее, за исключением весьма конкретных моделей Cre, удаление белка в течение ткани или клеточной популяции часто приводит к сложным фенотипами, происходящими из нескольких взаимодействующих механизмов. Определения, является ли результаты фенотип от срыва автономного клеточного механизма, который присущ клетки в вопросе, или от автономного механизма предотвращения клеток, которые возникнут в результате обесценения внешней среды, клетки, может быть трудно различить. Чтобы получить представление о функции белка в контексте, в естественных условиях, в маточно электропорации (ИЭГ) позволяет делеции гена в небольшой группе клеток в развивающемся коры или какой-либо другой выбранной области головного мозга. ИЭГ может использоваться для решения конкретных проблем головного мозга, в том числе спинной конечного мозга, медиальной мозге, гиппокампе, или ганглионарной возвышения. Это облегчает наблюдения; ОF последствий клеток автономной делеции гена в контексте здоровую окружающую среду. Цель этого протокола заключается, чтобы показать, как ИЭГ может быть использована для анализа дефект в радиальном миграции в floxed трансгенной линии мышей, с акцентом на различия между клеток автономных и не клеточных автономных эффектов белка удаления. Сравнивая фенотип в результате делеции гена в пределах всей коре по сравнению с ИЭГ-опосредованной делеции гена в ограниченном клеточной популяции, более глубокое понимание функции белка в развитии мозга может быть получено, чем при использовании либо технику в изоляции.
Introduction
Радиальная миграция является центральный процесс начале развития коры. Это зависит от различных клеточных автономных факторов, таких как правильный выход митотической и нейрональной дифференцировки, клеточной полярности, регулирование динамики цитоскелета и экспрессии трансмембранных рецепторов, а также не-клеточных автономных факторов, таких как формирование радиальной глии строительные леса и секреция миграционной руководством молекул 1-3. С нарушением какого-либо из этих механизмов может привести к ухудшению миграцию нейронов в трансгенной мыши модели 4-8, определения основную причину дефекта в миграции может быть сложным и трудным процессом. Внутриутробное электропорации (ИЭГ) могут быть использованы для дополнения и упрощения интерпретация фенотипа генетического плей-модели и тем самым выяснить важные механизмы, необходимые для радиального миграции 7,9-11.
Внутриутробное электропорации (ИЭГ) является процесс, при котором плазмида лай нг как представляющий интерес ген и репортеру вводят в желудочек головного мозга мыши или крысы эмбриона, а затем втягивается в клетках, выстилающих желудочек через использование электрического тока 12-14. Это позволяет исследователю проанализировать эффект вверх или вниз регулирования гена в развитии или функции электропорации нейронов. После ИЭГ, мозги могут быть обработаны для иммуногистохимии 7,9-11, электрофизиологии 15 или культуре клеток 16,17. Основным преимуществом является то, что МСЭ в позволяет высокой удельной манипуляции экспрессии генов. Кроме того, Институт экономики города могут быть использованы для нацеливания на определенную область развивающегося мозга через направленной тока (рис 2). ИЭГ также могут быть использованы для нацеливания на определенную тип клеток за счет инъекции плазмид, несущих гены под контролем различных промоторов или систем активации плазмиду (тетрациклин индуцированной экспрессии гена, является примером) 10,18-21.
jove_content "> ИЭГ может быть использован в сочетании с Cre-LOX опосредованного генного вырезания системы 7-9,11,22. плазмиду, содержащую ген, кодирующий сообщение для белка Cre может быть электропорации в эмбрион, гомозиготных по аллелю (floxed в котором ген или ДНК конкретных областей примыкают два LoxP участков для Cre опосредованной рекомбинации ДНК). Cre затем индуцируют рекомбинацию интересующего гена в частности, в электропорации нейронных предшественников, создавая нокаут в floxed allele.The эффекта нокдаун белка на нейронной миграции и развития в отдельных нейронов могут быть изучены. Электропорация Cre вызывает рекомбинацию лишь в небольшом населения пораженных клеток, в результате чего опорную среду неповрежденными. В противоположность этому, конкретные ткани экспрессия Cre под контролем специфического типа клеток промоутер, происходит в течение всей ткани так, чтобы обе мигрирующих нейробластов и окружающая среда могут быть затронуты. Таким образом, Juxtaposition из этих двух подходов не может определить, является ли данный миграция дефект в связи с клеточно-автономными или сотовые неавтономных механизмы. Неисправный миграция в обеих экспериментальных системах о том, что результаты наблюдений фенотипа от А автономной клеточного механизма; нормальным миграции следующие электропорации Cre с дефектной миграции в ткани конкретной модели Cre означает, что интерес ген действует через автономную механизма без клеток.ИЭГ также может быть использован для выполнения аварийно-спасательных эксперименты по электропорации потенциальных взаимодействующих генов в выбивают животных 7,9,10. Например, следователь может попытаться спасти миграции фенотип трансгенных модели, электропорации нисходящего цели и определения, если дефект миграции корректируется в электропорации нейронов. Это имеет дополнительное преимущество, что успешное спасение указывает, что нормальная миграция может быть восстановлено путем манипулирования экспрессию белка в спеспецифичны нейронов, даже если окружающая среда по-прежнему недостаточно для целевого гена. Опять же, этот подход требует больше времени и экономически эффективным, чем пересечение или получения трансгенных линий, с дополнительным преимуществом определения наличия дефектных механизм клеточной автономно.
ИЭГ может использоваться для отслеживания миграции нейронов путем электропорации репортерной плазмиды в выбить эмбрионов (фиг.4С). Как только нейроны, выстилающие желудочка во время операции подвергали электропорации 17, ИЭГ может использоваться, чтобы следовать нейронов, рожденных в определенный момент времени с преимуществом визуализации их морфологии в естественных условиях.
Наконец, можно использовать МСЭ целевой области мозга, такие как медиальной или спинной конечного мозга, гиппокампе или Ганглионарный бугорок (рисунок 2). Это дает исследователям право расследовать функции гена в конкретной области, независимо от осложнений результатчисле из белка нокдаун в соседних структур.
Белок ретинобластомы (PRB), p107 и p130 составляют семейство карманных белков и хорошо зарекомендовали себя регуляторы выхода из клеточного цикла. Тем не менее, появляется все больше доказательств того, что эти белки регулируют также клеточного цикла независимых аспекты развития нервной системы. Как мы уже показала, НРБ и p107 играют решающую роль как в тангенциальном 4,23 и радиально миграции 6. Здесь мы демонстрируем роль карман белка члены семьи PRB и P107 на нервной миграции 6 для иллюстрации использования в утробе матери электропорации Cre в трансгенной модели. Таким образом, Институт экономики города обеспечивает мощный способ анализа клеток автономные эффекты делеции гена (или избыточной экспрессии). В сочетании с конкретной выбить модели ткани ИЭГ может предоставить дополнительную информацию о механизмах, контролирующих нейронной миграции.
Protocol
Representative Results
Discussion
Два из основных проблем при выполнении внутриутробному electroporations являются: 1) предотвращение эмбриона летальность 2) уменьшения изменчивости между electroporations. Одним из наиболее важных факторов в предотвращении летальность качество иглы, как тупые иглы нанести больший ущерб эмбрион?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are indebted to Pierre Mattar and Freda Miller for their assistance with the in utero electroporation and to Noel Ghanem and Bensun Fong for creating diagrams. We thank Linda Jui and Jason G. MacLaurin for excellent technical assistance. Equipment was supported by the Centre for Stroke Recovery.
This work was supported by a scholarship from HSFO and OGS to D.S.S. and a CIHR grant to R.S.S.
Materials
| Table 1: Equipment and Materials | ||||
| Product Name | Company | Catalog Number | Description | |
| ECM 830 Square Wave Electroporator | BTX Harvard Apparatus | 45-0052 | Electroporator only – buy cables separately (45-0204) | |
| 1250FS Footswitch for ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0211 | Foot paddle is necessary for hands-free electroporation | |
| Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0489 (5mm) 45-0488 (7mm) | Platinum forcep style electrodes | |
| Femtojet | Eppendorf | 920010504 | Microinjector | |
| Griphead 0 | Eppendorf | 920007414 | Holds the pulled needle | |
| Universal Capillary Holder | Eppendorf | 920007392 | Connects griphead to tube | |
| Injection Tube | Eppendorf | 920007431 | Connects capillary holder to Femtojet | |
| Foot Control | Eppendorf | 920005098 | Foot paddle for hands-free injection | |
| Microloader Tips | Eppendorf | 930001007 | Tips for loading the pulled capillary tubes | |
| Plasmid Mega Kit | Qiagen | 12181 | 5 QIAGEN-tip 2500, Reagents, Buffers | |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | Non-toxic dye | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | For trimming the needles | |
| Bonn Strabismus Scissors | Fine Science Tools | 14084-09 | ||
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | Straight | |
| Colibri Retractors | Fine Science Tools | 17000-03 | ||
| Stapler | Fine Science Tools | 12031-07 | For 7mm clips | |
| Castroviejo Needle Holder | Medical Tools | SNH-6737 | Straight, with lock | |
| Needle Puller | Narishige | PC-10 | For pulling microcappillaries | |
| Microcapillaries | Drummond | 1-000-800 | 0.4 mm inner diameter glass capillary tubes | |
Riferimenti
- Hippenmeyer, S. Molecular pathways controlling the sequential steps of cortical projection neuron migration. Adv. Exp. Med. Biol. 800, 1-24 (2014).
- Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. Integrative mechanisms of oriented neuronal migration in the developing brain. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 29, 299-353 (2013).
- Wu, Q., et al. The dynamics of neuronal migration. Adv. Exp. Med. Biol. 800, 25-36 (2014).
- McClellan, K. A., et al. Unique requirement for Rb/E2F3 in neuronal migration: evidence for cell cycle-independent functions. Mol. Cell. Biol. 27 (13), 4825-4843 (2007).
- Nguyen, L., et al. P27kip1 Independently Promotes Neuronal Differentiation and Migration in the Cerebral Cortex. Genes Dev. 20 (11), 1511-1524 (2006).
- Svoboda, D. S., Paquin, A., Park, D. S., Slack, R. S. Pocket proteins pRb and p107 are required for cortical lamination independent of apoptosis. Dev. Biol. 384 (1), 101-113 (2013).
- Hashimoto-Torii, K., et al. Interaction between Reelin and Notch signaling regulates neuronal migration in the cerebral cortex. Neuron. 60 (2), 273-284 (2008).
- Ori-McKenney, K. M., Vallee, R. B. Neuronal migration defects in the Loa dynein mutant mouse. Neural Dev. 6, (2011).
- Wang, H., Ge, G., Uchida, Y., Luu, B., Ahn, S. Gli3 is required for maintenance and fate specification of cortical progenitors. J. Neurosci. 31 (17), 6440-6448 (2011).
- Heng, J. I., et al. Neurogenin 2 controls cortical neuron migration through regulation of Rnd2. Nature. 455 (7209), 114-118 (2008).
- Alfano, C., et al. COUP-TFI promotes radial migration and proper morphology of callosal projection neurons by repressing Rnd2 expression. Development. 138 (21), 4685-4697 (2011).
- De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Prog. Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).
- Dixit, R., et al. Efficient gene delivery into multiple CNS territories using in utero electroporation. J. Vis. Exp. (52), (2011).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
- Elias, G. M., Elias, L. A., Apostolides, P. F., Kriegstein, A. R., Nicoll, R. A. Differential trafficking of AMPA and NMDA receptors by SAP102 and PSD-95 underlies synapse development. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (52), 20953-20958 (2008).
- Bhuiyan, M. I., Lee, J. H., Kim, S. Y., Cho, K. O. Expression of exogenous LIN28 contributes to proliferation and survival of mouse primary cortical neurons in vitro. Neuroscienze. 248C, 448-458 (2013).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons. J. Vis. Exp. (44), (2010).
- Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).
- Miyagi, S., et al. The Sox-2 regulatory regions display their activities in two distinct types of multipotent stem cells. Mol. Cell. Biol. 24 (10), 4207-4220 .
- Wang, X., Qiu, R., Tsark, W., Lu, Q. Rapid promoter analysis in developing mouse brain and genetic labeling of young neurons by doublecortin-DsRed-express. J. Neurosci. Res. 85 (16), 3567-3573 (2007).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb. Cortex. 19, 120-125 (2009).
- Bouabe, H., Gene Okkenhaug, K. targeting in mice: a review. Methods Mol. Biol. 1064, 315-336 (2013).
- Ferguson, K. L., et al. A cell-autonomous requirement for the cell cycle regulatory protein, Rb, in neuronal migration. EMBO J. 24 (24), 4381-4391 (2005).
- Lagace, D. C., et al. Dynamic contribution of nestin-expressing stem cells to adult neurogenesis. J. Neurosci. 27 (46), 12623-12629 (2007).
- Andrusiak, M. G., Vandenbosch, R., Park, D. S., Slack, R. S. The retinoblastoma protein is essential for survival of postmitotic neurons. J. Neurosci. 32 (42), 14809-14814 (2012).
- Shan, B., Chang, C. Y., Jones, D., Lee, W. H. The transcription factor E2F-1 mediates the autoregulation of RB gene expression. Mol. Cell. Biol. 14 (1), 299-309 .
- Ferland, R. J., Cherry, T. J., Preware, P. O., Morrisey, E. E., Walsh, C. A. . Characterization of Foxp2 and Foxp1 mRNA and protein in the developing and mature brain. 460 (2), 266-279 (2003).
