Un procédé de criblage et de validation des mutations de résistance aux inhibiteurs de kinase
Summary
Emergence de la résistance génétique contre la thérapie d'inhibiteur de kinase pose défi important pour la thérapie efficace contre le cancer. Identification et caractérisation des mutations de résistance contre un médicament nouvellement développé contribue à une meilleure gestion clinique et la conception de médicaments de la prochaine génération. Ici, nous décrivons notre protocole pour le dépistage in vitro et la validation de mutations résistantes.
Abstract
La découverte de BCR / ABL comme un oncogène du pilote dans la leucémie myéloïde chronique (LMC) ont abouti à l'élaboration d'Imatinib, ce qui, en fait, a démontré le potentiel de cibler la kinase dans les cancers en traitant efficacement les patients atteints de LMC. Cette observation a révolutionné le développement de médicaments afin de cibler les kinases oncogènes impliqués dans diverses autres tumeurs malignes, telles que, EGFR, B-RAF, KIT et PDGFR. Cependant, un inconvénient majeur des thérapies anti-kinase est l'émergence de mutations de résistance aux médicaments rendant la cible pour avoir réduit ou perdu affinité pour le médicament. Comprendre les mécanismes employés par variants résistants non seulement aide à développer les inhibiteurs de la prochaine génération, mais donne aussi une impulsion à la gestion clinique utilisant la médecine personnalisée. Nous avons signalé une stratégie rétroviral de vecteur à base de dépistage pour identifier le spectre de résistance conférant mutations dans BCR / ABL, qui a aidé à développer la prochaine génération BCR / ABL inhibiteurs. Utilisation Ruxolitinib et JAK2 comme une paire de cibles pharmaceutiques, ici nous décrivent des méthodes de dépistage in vitro qui utilise les cellules BaF3 de la souris exprimant la bibliothèque de mutation aléatoire de kinase JAK2.
Introduction
Les protéines kinases sont des enzymes intracellulaires réglementaires clés de voies de transduction du signal qui modulent apparemment tous la fonction cellulaire. Un contrôle approprié de médiation par la kinase de signalisation est essentielle à l'homéostasie et le développement, qui repose essentiellement sur une bonne régulation des kinases, des phosphatases et sa dégradation par UPS (système de protéasome ubiquitine). Kinases régulées sont au centre de la scène de nombreux cancers et l'hôte impliqués dans des maladies humaines 1. Génome humain code pour plus de 500 protéines kinases qui ont été liés, directement ou indirectement, à ~ 400 maladies humaines 2. Ces observations ont appuyé le concept de ciblage thérapeutique de kinases par les inhibiteurs à petites molécules 5.3.
La démonstration d'inhibiteurs de la kinase ABL, tels que l'imatinib dans le traitement de la leucémie myéloïde chronique (LMC) à condition que la preuve de concept de cette approche 6,7. Cette observation a non seulement révolutionné la fourmii-kinase thérapie mais aussi forcées l'idée d'identifier les lésions génétiques dans d'autres maladies néoplasiques pour ciblage thérapeutique, qui conduisent à la découverte de mutations oncogéniques dans le JAK2 de polyglobulie de Vaquez (PV) et les patients avec des syndromes myéloprolifératifs (NPP). Cette découverte a suscité un grand intérêt dans le traitement MPN en ciblant JAK2 avec de petites molécules inhibiteurs de kinases. Maintenant, près d'une douzaine d'inhibiteurs de JAK2 sont dans les essais cliniques et l'un d'eux a été récemment approuvé pour le traitement de la myélofibrose. Bien que le ciblage spécifique de kinases oncogènes par des inhibiteurs à petites molécules dans les cancers apporter résultat prometteur, il souffre également de développer une résistance au traitement. En fait, jusqu'à présent, les patients traités avec des inhibiteurs de kinase, tels que l'imatinib, gefitinib, erlotinib et le dasatinib développées mutations de résistance principalement en acquérant des mutations dans le domaine kinase de médicament qui cible 10/8. Résistance à la suite de la mutation génique met en évidence les limitations of monothérapie contre les kinases oncogènes ciblé, et représente le prochain défi dans le développement de la chimiothérapie du cancer de plus en plus de succès. Conséquences mécanistiques et fonctionnelles de la résistance aux médicaments devraient fournir une justification pour la sélection et la conception de composés gratuits pour le développement de médicaments. Mutations identifiées via des écrans in vitro, ont montré un haut degré de corrélation avec celles trouvées chez les patients. Par conséquent, dépistage in vitro de mutations qui confèrent la résistance aux médicaments pendant donnés paires de cibles de médicaments dans passes de développement clinique ou préclinique à identifier les profils de résistance qui sont susceptibles de provoquer une rechute clinique. L'identification de ces formes mutantes ne est pas seulement utile dans la surveillance des patients pour la réponse aux médicaments et à la rechute mais également essentiel pour la conception d'inhibiteurs plus robustes de la prochaine génération. Par exemple, le développement de la prochaine génération des inhibiteurs BCR / ABL, nilotinib et Ponatinib, ont été rendus possibles en raison d'une plus grande meccompréhensions hanistic gagné de mutagenèse, de structure, et des études fonctionnelles.
Plus tôt, nous avons présenté les résultats de notre écran à l'aide mutagenèse aléatoire de la BCR / ABL pour révéler le spectre des mutations conférant une résistance aux inhibiteurs comme l'imatinib 11,12, 12 PD 166326 et AP24163 13. Les résultats non seulement identifié les mutations conférant une résistance et la maladie rechute clinique, mais aussi à condition que la compréhension des mécanismes de résistance et de principes régissant la fonction kinase 11,14 drogue. Ici, nous donnons des détails méthodologiques supplémentaires, en utilisant ruxolitinib et JAK2 comme une paire de cibles pharmaceutiques, afin de permettre une application plus large de cette stratégie de dépistage.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le succès clinique de l'imatinib dans le traitement de la LMC a démontré non seulement le potentiel de cibler les kinases de rouge par les inhibiteurs de petites molécules, mais également les limites à découvert de thérapie ciblée: rechute clinique et l'émergence de mutations de résistance aux médicaments dans le gène cible. Identification de mutations de résistance contribue à une meilleure prise en charge clinique et le développement d'inhibiteurs de la prochaine génération. Ce protocole …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by grants to M.A. from NCI (1RO1CA155091), NHLBI (1R21HL114074) and the Leukemia Research Foundation. M.A. is a recipient of V-Scholar award from the V- Foundation. Authors are thankful to Dr. Sara Rohrabaugh for editing.
Materials
| name of Materials/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| Cell and Tissue culture | |||
| BaF3 Cells | ATCC | ||
| HEK293T cells | ATCC | ||
| pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW | A gift from Ross Levine | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/Y931C.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/L983F.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/P58A.GW | Made in house | ||
| pMSCV-V617F-Cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-Luciferase-puro.GW | Made in house | ||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | Atlanta biological | S11150 | |
| Trypsin EDTA 1X | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1XPBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | |
| Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5mg/ml stock in water |
| Trapan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
| INCB018424 (Ruxolitinib) | ChemieTeK | 941678-49-5 | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0.45uM acro disc filter | PALL | 2016-10 | |
| 70um nylon cell stariner | Becton Dickinson | 352350 | |
| Bacterial Culture | |||
| XL-1 red E.Coli cells | Agilent Tech | 200129 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100mg/ml stock solution |
| Bacto agar | Difco | 214050 | |
| Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
| Kits | |||
| Dneasy Blood& tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| Expand long template PCR system | Roche | 1168134001 | |
| Wizard Sv gel and PCR clean up system | Promega | A9282 | |
| Pure Yield plasmid mini prep system | Promega | A1222 | |
| PCR Cloning System with Gateway Technology with pDONR 221 & OmniMAX 2 Competent Cells | Invitrogen | 12535029 | |
| Gateway LR Clonase Enzyme mix | Invitrogen | 11791019 | |
| Mouse reagents | |||
| Vivo-Glo Luciferin in-vivo Grade | Promega | P1043 | |
| 1/2cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| Instruments | |||
| NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
| Swing bucket rotor centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | This is not necessary, one can use standard hemocytomemetr for cell counting | |
Riferimenti
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