Un método para la detección y validación de mutaciones de resistencia contra la quinasa Inhibidores
Summary
Aparición de resistencia genética contra la terapia con inhibidores de quinasa plantea reto significativo para la terapia del cáncer eficaz. Identificación y caracterización de mutaciones resistentes contra un fármaco recientemente desarrollado ayuda a una mejor gestión clínica y el diseño de fármacos de próxima generación. A continuación, describimos nuestro protocolo para la detección in vitro y la validación de las mutaciones resistentes.
Abstract
El descubrimiento de BCR / ABL como un oncogén conductor en la leucemia mieloide crónica (CML) dio como resultado el desarrollo de Imatinib, que, de hecho, demostró el potencial de focalizar la quinasa en los cánceres por tratar eficazmente los pacientes con LMC. Esta observación revolucionó el desarrollo de fármacos para orientar las quinasas oncogénicas implicado en varios otros tumores malignos, tales como, EGFR, B-RAF, KIT y PDGFR. Sin embargo, una desventaja importante de las terapias anti-quinasa es la aparición de mutaciones de resistencia a fármacos que prestan el objetivo de haber reducido o perdido afinidad por la droga. La comprensión de los mecanismos empleados por variantes resistentes no sólo ayuda en el desarrollo de los inhibidores de la próxima generación, sino también da impulso a la gestión clínica usando la medicina personalizada. Nos informó de una estrategia de cribado retroviral vector basado para identificar el espectro de resistencia que confiere mutaciones en BCR / ABL, lo que ha ayudado en el desarrollo de la próxima generación de BCR / ABL inhibidores. Utilizando Ruxolitinib y JAK2 como un par de objetivos farmacológicos, aquí nos describen en los métodos de cribado in vitro que utiliza las células BAF3 ratón que expresan la biblioteca mutación aleatoria de JAK2 quinasa.
Introduction
Las proteínas quinasas son enzimas reguladoras clave de las vías de transducción de señales intracelulares que aparentemente modulan cada función celular. Un adecuado control de la señalización mediada por la quinasa es crucial para la homeostasis y el desarrollo, que se basa principalmente en una adecuada regulación de quinasas, fosfatasas y su degradación por UPS (sistema ubiquitina proteasoma). Quinasas desreguladas están en el centro del escenario de muchos tipos de cáncer e implicado en multitud de enfermedades humanas 1. Genoma humano codifica más de 500 proteínas quinasas que se han relacionado, directa o indirectamente, a ~ 400 enfermedades humanas 2. Estas observaciones apoyaron el concepto de focalización terapéutica de quinasas por los inhibidores de moléculas pequeñas de 3-5.
La demostración de inhibidores de la quinasa ABL, tales como Imatinib, en el tratamiento de la leucemia mieloide crónica (CML) proporcionó la prueba de concepto para este enfoque 6,7. Esta observación no solo revolucionó la hormigai-quinasa terapia, pero también hace cumplir la idea de identificar las lesiones genéticas en otras enfermedades neoplásicas para el enfoque terapéutico, que conducen al descubrimiento de mutaciones oncogénicas en el JAK2 de la policitemia vera (PV) y los pacientes con neoplasias mieloproliferativas (MPN). Este descubrimiento generó gran interés en el tratamiento de las MPN apuntando JAK2 con inhibidores de la quinasa de moléculas pequeñas. Ahora, casi una docena de inhibidores de JAK2 están en ensayos clínicos y uno de ellos ha sido aprobado recientemente para el tratamiento de la mielofibrosis. Si bien la orientación específica de quinasas oncogénicas por inhibidores de moléculas pequeñas en los cánceres traer resultados prometedores, que también sufre de desarrollar resistencia al tratamiento. De hecho, hasta ahora, los pacientes tratados con inhibidores de la quinasa, como Imatinib, Gefitinib, erlotinib y dasatinib desarrollaron mutaciones de resistencia en su mayoría mediante la adquisición de mutaciones en el dominio quinasa de qué fármaco se dirige a 08.10. Resistencia como resultado de la mutación del gen pone de relieve las limitaciones of dirigido monoterapia contra las quinasas oncogénicas, y representa el siguiente reto en el desarrollo de la quimioterapia del cáncer cada vez más éxito. Consecuencias mecánicas y funcionales de resistencia a los medicamentos deben proporcionar una justificación para la selección y el diseño de compuestos de cortesía para el desarrollo de fármacos. Las mutaciones identificadas a través de pantallas in vitro, han demostrado un alto grado de correlación con las que se encuentran en los pacientes. Por lo tanto, la detección in vitro de mutaciones que confieren resistencia a las drogas para un determinado objetivo pares de drogas en asistencias de desarrollo clínico o preclínico en la identificación de los patrones de resistencia que puedan causar la recaída clínica. La identificación de estas formas mutantes no sólo es útil en el seguimiento de los pacientes para la respuesta a los fármacos y la recaída, pero también es esencial para el diseño de inhibidores de próxima generación más robustos. Por ejemplo, el desarrollo de inhibidores de BCR / ABL de próxima generación, nilotinib y Ponatinib, fueron posibles debido a la mayor mecentendimientos hanistic ganaron de mutagénesis, estructurales y estudios funcionales.
Anteriormente, hemos informado de los resultados de nuestra pantalla usando mutagénesis aleatoria de BCR / ABL para revelar el espectro de mutaciones que confieren resistencia a los inhibidores como el Imatinib 11,12, PD166326 12 y 13 AP24163. Los resultados no sólo identificaron las mutaciones que confieren resistencia y la enfermedad recaída clínica, sino que también proporcionan la comprensión mecanicista de la resistencia y de los principios que rigen la función quinasa 11,14 drogas. Aquí proporcionamos detalles metodológicos adicional, usando ruxolitinib y JAK2 como un par de objetivos farmacológicos, para permitir una aplicación más amplia de esta estrategia de cribado.
Protocol
Representative Results
Discussion
El éxito clínico de imatinib en el tratamiento de la LMC demostró no sólo la posibilidad de dirigirse a las rouge quinasas por inhibidores de moléculas pequeñas, pero las limitaciones también al descubierto de la terapia dirigida: recaída clínica y la aparición de mutaciones de resistencia a fármacos en el gen diana. Identificación de mutaciones de resistencia ayuda a una mejor gestión clínica y el desarrollo de inhibidores de la próxima generación. Este protocolo describe una metodología para identific…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by grants to M.A. from NCI (1RO1CA155091), NHLBI (1R21HL114074) and the Leukemia Research Foundation. M.A. is a recipient of V-Scholar award from the V- Foundation. Authors are thankful to Dr. Sara Rohrabaugh for editing.
Materials
| name of Materials/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| Cell and Tissue culture | |||
| BaF3 Cells | ATCC | ||
| HEK293T cells | ATCC | ||
| pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW | A gift from Ross Levine | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/Y931C.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/L983F.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/P58A.GW | Made in house | ||
| pMSCV-V617F-Cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-Luciferase-puro.GW | Made in house | ||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | Atlanta biological | S11150 | |
| Trypsin EDTA 1X | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1XPBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | |
| Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5mg/ml stock in water |
| Trapan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
| INCB018424 (Ruxolitinib) | ChemieTeK | 941678-49-5 | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0.45uM acro disc filter | PALL | 2016-10 | |
| 70um nylon cell stariner | Becton Dickinson | 352350 | |
| Bacterial Culture | |||
| XL-1 red E.Coli cells | Agilent Tech | 200129 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100mg/ml stock solution |
| Bacto agar | Difco | 214050 | |
| Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
| Kits | |||
| Dneasy Blood& tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| Expand long template PCR system | Roche | 1168134001 | |
| Wizard Sv gel and PCR clean up system | Promega | A9282 | |
| Pure Yield plasmid mini prep system | Promega | A1222 | |
| PCR Cloning System with Gateway Technology with pDONR 221 & OmniMAX 2 Competent Cells | Invitrogen | 12535029 | |
| Gateway LR Clonase Enzyme mix | Invitrogen | 11791019 | |
| Mouse reagents | |||
| Vivo-Glo Luciferin in-vivo Grade | Promega | P1043 | |
| 1/2cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| Instruments | |||
| NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
| Swing bucket rotor centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | This is not necessary, one can use standard hemocytomemetr for cell counting | |
Riferimenti
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