Fremstilling af en blodkultur Pellet til hurtig bakteriel identifikation og antibiotikaresistens undersøgelserne

Summary

En hurtig bakteriel præparat pellet fra en positiv blod kultur kan anvendes som en prøve til applikationer, såsom identifikation af MALDI-TOF, Gram farvning, antibiotisk følsomhedstest og PCR-baserede test. Resultaterne kan hurtigt meddeles klinikere at forbedre resultatet af patienter med blodforgiftning.

Abstract

Blodbanen infektioner og sepsis er en væsentlig årsag til sygelighed og dødelighed. Det vellykkede resultat af patienter med bakteriæmi afhænger af en hurtig identifikation af smitstoffet at vejlede en optimal behandling med antibiotika. Hurtigt kan udføres analyse af Gram pletter fra positiv blod kultur og allerede påvirke den antibiotiske regime betydeligt. Men den nøjagtige identifikation af det infektiøse agens stadig forpligtet til at etablere den optimale målrettet behandling. Vi præsenterer her en enkel og hurtig bakteriel forberedelse pellet fra en positiv blod kultur, der kan anvendes som en prøve til flere vigtige downstream-applikationer, såsom identifikation af MALDI-TOF MS, antibiotika resistensbestemmelse (AST) af disk diffusion assay eller automatiserede AST systemer og ved automatiseret PCR-baseret diagnostisk test. Udførelsen af ​​disse forskellige identifikationsnumre og AST, der anvendes direkte på blodkultur bakterielle piller er meget siMilar udførelsen normalt udvindes af isolerede kolonier dyrket på agarplader. Sammenlignet med konventionelle metoder, den hurtige overtagelse af en bakteriel pille reducerer den tid til at rapportere både identifikation og AST betydeligt. Således kan følgende blod kultur positivitet, identifikation af MALDI-TOF indberettes inden for mindre end 1 time hvorimod resultaterne af AST fra automatiske AST systemer eller disk diffusion analyser inden for 8 til 18 timer, hhv. Ligeledes kan resultaterne af en hurtig PCR-baseret analyse meddeles de klinikere mindre end 2 timer efter rapporten fra en bakteriæmi. Tilsammen viser disse resultater, at en hurtig udarbejdelse af en blod kultur bakteriepellet har en betydelig indvirkning på identifikation og AST ekspeditionstid og dermed på det vellykkede resultat af patienter, der lider infektioner i blodbanen.

Introduction

Blodbanen infektioner og sepsis hos indlagte patienter er en væsentlig årsag til sygelighed og dødelighed. Således er observeret dødelighed relateret til infektioner i blodet på omkring 14% til 37% af indlagte patient og kan stige til 35% i intensivafdelinger patienter ^1-3. Hurtig identifikation af smitstoffet er afgørende at vejlede optimal antimikrobiel behandling og øge det vellykkede resultat af antimikrobiel terapi ^4,5. Den hurtige analyse af Gram pletter fra positiv blod kultur har allerede en betydelig indvirkning på tilpasningen af antimikrobiel behandling ^6,7 men præcis identifikation af smitstoffet er forpligtet til at yde den bedst tilpassede antibiotisk behandling til patienterne. For eksempel forskellige antibiotika behandlingsregimer skal gennemføres efter bakteriæmi med enterokokker og streptokokker, der er vanskelige at skelne fra Gram farvning. Ligeledes identifikation på de arter Level er påkrævet for at detektere gramnegative enterobakterier koder for et kromosomalt AMPC gen, som giver en forøget resistens over for β-lactamer ^8.

Med en positiv blod kultur, den konventionelle diagnostiske metode er at videredyrke smitstoffet på forskellige agarplader, der kræver flere timers ekstra inkubation forudgående identifikation med forskellige tilgange, herunder biokemiske tests, vækst på forskellige selektive medier og automatiserede mikrobielle identifikationssystemer. Tiden til resultaterne af en konventionel diagnostisk fremgangsmåde er på omkring 1 til 3 dage.

Fremkomsten af ​​matrix-assisteret laser desorption / ionisering tid-of-flight massespektrometri (MALDI-TOF)-teknologi til hurtig identifikation af mikroorganismer har givet et nyt redskab til hurtigt at identificere mikroorganismer fra kolonier dyrket på agarplader, men også direkte fra positiv blod kulturer (figur 1) ^9-12. The brug af MALDI-TOF at identificere et smitstof fra blodkulturer har reduceret tid til resultaterne til et par minutter i stedet for de timer og dage, der kræves ved traditionelle metoder. Som diskuteret af Croxatto et al. ¹³ effektiviteten af MALDI-TOF-identifikation bygger på forskellige parametre, herunder mikroorganismen renhed og mængde. Disse to kriterier er nemt fås fra diskrete kolonier dyrket på agarplader, men krævede en præ-analytisk behandling for bakteriel berigelse og oprensning fra komplekse prøver såsom blod kultur, som indeholder flere cellulære og protein komponenter, der kan interferere med MALDI-TOF identifikation.

Forskellige mikroorganismer isolation metoder fra blod kultur er blevet brugt i en række undersøgelser, herunder saponin eller andre milde rengøringsmidler metode til bakteriel ekstraktion ^9,14, serum separator metode ¹⁰ Lysis centrifugering metoder ¹² </sop> og kommercielt løsninger som den sepsityper kit. Vores bakteriologi diagnostisk laboratorium har udviklet en simpel blod-kultur bakteriepellet forberedelse baseret på ammoniumchlorid erythrocyt-lyse, som gør det muligt hurtigt at identificere bakterier og gær ved MALDI-TOF og automatiserede identifikationssystemer (figur 2) ^15. Dette blod-kultur pille præparat også give en prøve til andre direkte downstream-applikationer såsom Gram-farvning, automatiserede PCR-baserede diagnostiske tests såsom POCT-PCR til hurtig påvisning af methicillin-resistente Staphyloccocus aureus (MRSA), og antibiotikaresistens undersøgelserne med automatiserede AST og / eller ved disk diffusion assays på agarplader (Figur 3).

I dette arbejde har vi beskrive de forskellige trin til fremstilling af blod-kultur bakteriepellet som forklaret af Prod'hom et al. ¹⁵ (figur 4). Vi vil også deskriftlærde protokollerne for tre af de vigtigste programmer, der kan udføres på blod kultur pille: Identifikation ved MALDI-TOF ^15, identifikation (ID), og antibiotisk følsomhedstestning (AST) med de automatiserede systemer ¹⁶ for enterobakterier og stafylokokker og automatiseret PCR- baseret diagnostisk test til påvisning af MRSA ^17.

Protocol

Denne protokol er blevet udviklet og valideret efter forskning og udviklingsprocesser og etiske regler på vores institution før de bliver implementeret som en rutinemæssig værktøj. 1. Fremstilling af en blodkultur bakteriepellet af Ammoniumklorid Erythrocyte-lyserende Procedure Fremstilling af en positiv blod kultur for efterfølgende centrifugering. Steriliser blodkultur hætte. Tilføj 70% ethanol på hætten af ​​flasken og brænde det. BEMÆRK: Du må …

Representative Results

I udføres af Prod'hom et al. 15 undersøgelse blev bakterielle opnåede pellets af ammoniumchlorid lysis centrifugering af 122 positivt blod kultur fra 78 patienter analyseret ved MALDI-TOF-MS. Ud af 122 positiv blod kultur, blev 95 (77,9%) korrekt identificeret på artsniveau og én (0,8%) ved slægten niveau. De resterende 26 (21,3%) blod kultur piller gav ingen pålidelig identifikation af MALDI-TOF. Blandt dem var 21 gram-positive bakterier, herunder 13 streptokokker og 5 koagulase-negative …

Discussion

Sammenlignet med konventionelle positiv blod kultur diagnostiske metoder, den hurtige overtagelse af en bakteriel pille ved hjælp af ammoniumchlorid lyse centrifugering tilgang reducere den tid til at rapportere identifikation af 16 til 24 timer, og tiden til at rapportere AST ved 24 til 48 timer (figur 1 og 3).

Hurtig indførelse af passende antibiotikabehandling er afgørende at forbedre resultatet af patienter, der lider af infektioner i blodbanen. Således tidlig identi…

Materials

20 needle gauge	Terumo, Leuven, Belgium	NN-2038R
50 ml Falcon tube	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	352070	50 ml centrifuge tubes
Ammonium chlorure	Merck, Darmstadt, Germany	101145
Potassium hydrogen carbonate	Fluka, St. Louis, MO, USA	60340
Formic acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	F0507	Flammable, corrosive
a-Cyano-4-hydroxycinnamic acid	Fluka, St. Louis, MO, USA	70990	Acute toxicity
Acetonitrile	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	271004	Flammable, acute toxicity
Trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T6508	Corrosive, acute toxicity
Vitek 2 60 instrument	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	27202	automated microbial system instrument
Vitek 2 Gram-positive (GP) card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	21342	automated GP  identification card
Vitek 2 AST-P580 card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	22233	automated microbial AST system
Vitek 2 Gram-negative (GN) card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	21341	automated GN  identification card
Vitek 2 AST-N242 card	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	413391	automated microbial AST system
Xpert MRSA	Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA	GXMRSA-100N-10	nucleic acid amplification technology MRSA
GeneXpert IV instrument	Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA	GXIV-4-D	nucleic acid amplification technology instrument
Microflex LT MALDI-TOF MS instrument	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	BDAL microflex LT/SH
MSP 96 target  steel BC	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	280799	MALDI target plate
Densitometer Densicheck instrument	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	27208
MALDI Sepsityper kit 50	Bruker Daltonics, Bremen, Germany	8270170
Mac Conkey agar	Biolife, Milano, Italy	4016702
Mueller-Hinton agar	Oxoid, Hampshire, England	CM0337	Mueller-Hinton agar (MH)
MHF agar	Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France	43901	Mueller-Hinton agar-fastidious organisms agar (MHF)
BD columbia III agar	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	254071	blood agar
BD chocolate agar	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	254089	chocolate agar
BD schaedler agar	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	254084	Schaedler agar