Voorbereiding van een Bloed Cultuur Pellet voor snelle identificatie van bacteriën en antibiotica gevoeligheid testen
Summary
Een snelle bacteriële pellet bereiding van een positieve bloedkweek kan worden gebruikt als een monster voor toepassingen zoals identificatie door MALDI-TOF, Gram-kleuring, antibiotica gevoeligheidstesten en PCR-gebaseerde test. De resultaten kunnen snel worden meegedeeld aan artsen om de uitkomst van patiënten die lijden aan infecties in het bloed te verbeteren.
Abstract
Bloedbaan infecties en sepsis zijn een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit. De succesvolle uitkomst van patiënten met bacteriëmie, hangt af van een snelle identificatie van de ziekteverwekker om een optimale behandeling met antibiotica te begeleiden. De analyse van Gramkleuringen van positieve bloedkweek kan snel worden uitgevoerd en reeds een aanzienlijke invloed hebben op de antibiotica kuur. Echter, is de nauwkeurige identificatie van het infectueuze agens nog steeds vereist om de optimale gerichte behandeling stellen. We presenteren hier een eenvoudige en snelle bacteriële pellet bereiding van een positieve bloedkweek die kan worden gebruikt als een monster voor meerdere essentiële verdere toepassingen zoals identificatie door MALDI-TOF MS, antibiotica gevoeligheidstest (AST) door disc diffusie assay of geautomatiseerde systemen AST en geautomatiseerde PCR-gebaseerde diagnostische test. De uitvoering van deze verschillende identificatie en AST die rechtstreeks aangebracht op de bloedkweek bacteriële pellets zeer siMilar de prestaties gewoonlijk verkregen uit geïsoleerde kolonies gekweekt op agarplaten. Vergeleken met conventionele benaderingen, de snelle verwerving van een bacteriële pellet vermindert de tijd zowel identificatie en AST rapporteren. Zo kan na bloedkweek positiviteit, identificatie door MALDI-TOF worden gemeld binnen minder dan 1 uur, terwijl de resultaten van AST door geautomatiseerde AST systemen of disc diffusie testen binnen 8 tot 18 uur, respectievelijk. Evenzo kunnen de resultaten van een snelle PCR gebaseerde bepaling de clinici worden meegedeeld minder dan 2 uur na het verslag van een bacteremia. Samen tonen deze resultaten aan dat de snelle voorbereiding van een bloedkweek bacteriële pellet heeft een belangrijke invloed op de identificatie en de AST doorlooptijd en dus op de goede afloop van de patiënten die lijden aan infecties in het bloed.
Introduction
Bloedbaan infecties en sepsis bij gehospitaliseerde patiënten een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit. Zo is de sterfte gerelateerd aan infecties bloedbaan waargenomen bij ongeveer 14% tot 37% van de gehospitaliseerde patiënt en kan op de intensive care-patiënten 1-3 te verhogen tot 35%. De snelle identificatie van de ziekteverwekker is cruciaal voor een optimale antimicrobiële behandeling te begeleiden en om de goede afloop van de antimicrobiële therapie 4,5 te verhogen. De snelle analyse van Gramkleuringen van positieve bloedkweek reeds een aanzienlijke invloed op de aanpassing van antimicrobiële therapie 6,7 maar nauwkeurige identificatie van het infectueuze agens moet de meest geschikte antibiotica om de patiënt te voorzien. Bijvoorbeeld, verschillende antibiotica behandelingen moeten worden uitgevoerd na bacteriëmie met enterokokken en streptokokken die moeilijk te onderscheiden door Gram-kleuring zijn. Ook de identificatie van de soort Level moet Gram negatieve enterobacteriën detecteren codeert AmpC een chromosomaal gen dat een verhoogde resistentie tegen 8-lactamen β.
Met een positieve bloedkweek, conventionele diagnostische benadering is de ziekteverwekker van verschillende agarplaten, die verscheidene uren extra incubatie voorafgaande identificatie met verschillende benaderingen zoals biochemische tests groei van verschillende selectieve media en geautomatiseerde microbiële identificatiesystemen vereist subcultuur. De tijd om resultaten van een conventionele diagnostische benadering is van ongeveer 1 tot 3 dagen.
De opkomst van de matrix-geassisteerde laser desorptie / ionisatie time-of-flight massaspectrometrie (MALDI-TOF) techniek voor snelle identificatie van micro-organismen is een nieuw hulpmiddel om snel micro-organismen kolonies gekweekt op agarplaten ook direct identificeren van positieve bloed ontvangen kweken (figuur 1) 9-12. The gebruik van MALDI-TOF om een infectueus agens te identificeren van bloedkweken is aanzienlijk verminderd de tijd om de resultaten om een paar minuten in plaats van de uren en dagen die door de traditionele methoden. Zoals besproken door Croxatto e.a.. 13, de efficiëntie van MALDI-TOF identificatie berust op verschillende parameters zoals zuiverheid en hoeveelheid van de micro-organisme. Deze twee criteria worden gemakkelijk verkregen uit afzonderlijke kolonies gekweekt op agarplaten maar vereist een pre-analytische behandeling van bacteriële verrijking en zuivering uit complexe monsters zoals bloed cultuur, die meerdere cellulaire en eiwit componenten die kunnen interfereren met MALDI-TOF identificatie bevatten.
Isolatiemethoden van bloedkweek Verschillende micro-organismen "zijn gebruikt in een aantal studies waaronder saponine of andere milde detergentia vormen voor bacteriële extractie 9,14, serumscheidingsbuisjes methode 10, lysis centrifugatiewerkwijzen 12 </sup> en commercieel oplossingen zoals het sepsityper kit. Onze bacteriologie diagnostisch laboratorium heeft een eenvoudige bloed-kweek bacteriële pellet bereiding op basis van ammoniumchloride erytrocyt-lysis dat snelle identificatie van bacteriën en gist door MALDI-TOF en automatische identificatiesystemen (figuur 2) 15 toe ontwikkeld. Dit bloed-kweek pellet preparaat ook een voorbeeld voor andere directe verdere toepassingen zoals Gram kleuring, geautomatiseerde PCR-gebaseerde diagnostische testen zoals POCT-PCRs voor de snelle detectie van methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) en antibioticum gevoeligheidstests met AST geautomatiseerde systemen en / of disk diffusie assays op agarplaten (figuur 3).
In dit werk beschrijven we de verschillende stappen voor de bereiding van de bloed-kweek bacteriële pellet zoals door Prod'hom e.a.. 15 (figuur 4). We zullen ook Deschrijver de protocollen voor drie van de belangrijkste toepassingen die worden uitgevoerd op de bloedkweek pellet: Identificatie met MALDI-TOF 15, identificatie (ID) en antibiotica gevoeligheidstests (AST) met geautomatiseerde systemen 16 voor Enterobacteriaceae en stafylokokken en geautomatiseerde PCR gebaseerde diagnostische test voor de detectie van MRSA 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vergeleken met conventionele positieve bloedkweek diagnostische benaderingen snelle verwerving van een bacteriële pellet met de ammoniumchloride lysis centrifugatie benadering verminderen de tijd tot identificatie rapporteren door 16 tot 24 uur en de tijd AST door 24 rapporteren aan 48 uur (Figuren 1 en 3).
Snelle invoering van geschikte antibiotica therapie is van cruciaal belang voor de uitkomst van patiënten die lijden aan infecties in het bloed te verbeteren. Aldus vro…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de technici van de bacteriologie laboratorium van het Universitair Ziekenhuis Centrum van Lausanne voor hun hulp om de technieken in het laboratorium uit te voeren.
Materials
| 20 needle gauge | Terumo, Leuven, Belgium | NN-2038R | |
| 50 ml Falcon tube | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 352070 | 50 ml centrifuge tubes |
| Ammonium chlorure | Merck, Darmstadt, Germany | 101145 | |
| Potassium hydrogen carbonate | Fluka, St. Louis, MO, USA | 60340 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F0507 | Flammable, corrosive |
| a-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Fluka, St. Louis, MO, USA | 70990 | Acute toxicity |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 271004 | Flammable, acute toxicity |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T6508 | Corrosive, acute toxicity |
| Vitek 2 60 instrument | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 27202 | automated microbial system instrument |
| Vitek 2 Gram-positive (GP) card | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 21342 | automated GP identification card |
| Vitek 2 AST-P580 card | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 22233 | automated microbial AST system |
| Vitek 2 Gram-negative (GN) card | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 21341 | automated GN identification card |
| Vitek 2 AST-N242 card | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 413391 | automated microbial AST system |
| Xpert MRSA | Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA | GXMRSA-100N-10 | nucleic acid amplification technology MRSA |
| GeneXpert IV instrument | Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA | GXIV-4-D | nucleic acid amplification technology instrument |
| Microflex LT MALDI-TOF MS instrument | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | BDAL microflex LT/SH | |
| MSP 96 target steel BC | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 280799 | MALDI target plate |
| Densitometer Densicheck instrument | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 27208 | |
| MALDI Sepsityper kit 50 | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 8270170 | |
| Mac Conkey agar | Biolife, Milano, Italy | 4016702 | |
| Mueller-Hinton agar | Oxoid, Hampshire, England | CM0337 | Mueller-Hinton agar (MH) |
| MHF agar | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 43901 | Mueller-Hinton agar-fastidious organisms agar (MHF) |
| BD columbia III agar | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 254071 | blood agar |
| BD chocolate agar | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 254089 | chocolate agar |
| BD schaedler agar | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 254084 | Schaedler agar |
Riferimenti
- Alberti, C., et al. Epidemiology of sepsis and infection in ICU patients from an international multicentre cohort study. Intensive care medicine. 28, 108-121 (2002).
- Angus, D. C., et al. Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care. Critical care medicine. 29, 1303-1310 (2001).
- Vincent, J. L., et al. Sepsis in European intensive care units results of the SOAP study. Critical care medicine. 34, 344-353 (2006).
- Micek, S. T., et al. Empiric combination antibiotic therapy is associated with improved outcome against sepsis due to Gram-negative bacteria a retrospective analysis. Antimicrob Agents Chemother. 54, 1742-1748 (2010).
- Seifert, H. The clinical importance of microbiological findings in the diagnosis and management of bloodstream infections. Clin Infect Dis. 48, S238-S245 (2009).
- Barenfanger, J., et al. Decreased mortality associated with prompt Gram staining of blood cultures. American journal of clinical pathology. 130, 870-876 (2008).
- Munson, E. L., Diekema, D. J., Beekmann, S. E., Chapin, K. C., Doern, G. V. Detection and treatment of bloodstream infection: laboratory reporting and antimicrobial management. J Clin Microbiol. 41, 495-497 (2003).
- Clerc, O., et al. Impact of matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry on the clinical management of patients with Gram-negative bacteremia a prospective observational study. Clin Infect Dis. 56, 1101-1107 (2013).
- Meex, C., et al. Direct identification of bacteria from BacT/ALERT anaerobic positive blood cultures by MALDI-TOF MS MALDI Sepsityper kit versus an in-house saponin method for bacterial extraction. Journal of medical microbiology. 61, 1511-1516 (2012).
- Moussaoui, W., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vials. Clin Microbiol Infect. 16, 1631-1638 (2010).
- Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis. 49, 543-551 (2009).
- Stevenson, L. G., Drake, S. K., Murray, P. R. Rapid identification of bacteria in positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol. 48, 444-447 (2010).
- Croxatto, A., Prod&34hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiol Rev. 36, 380-407 (2012).
- Chen, J. H., et al. Direct bacterial identification in positive blood cultures by use of two commercial matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry systems. J Clin Microbiol. 51, 1733-1739 (2013).
- Prod&34hom, G., Bizzini, A., Durussel, C., Bille, J., Greub, G. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for direct bacterial identification from positive blood culture pellets. J Clin Microbiol. 48, 1481-1483 (2010).
- Prod&34hom, G., Durussel, C., Greub, G. A simple blood-culture bacterial pellet preparation for faster accurate direct bacterial identification and antibiotic susceptibility testing with the VITEK 2 system. Journal of medical microbiology. 62, 773-777 (2013).
- Clerc, O., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry and PCR-based rapid diagnosis of Staphylococcus aureus bacteraemia. Clin Microbiol Infect. , (2013).
- Martiny, D., et al. Impact of rapid microbial identification directly from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry on patient management. Clin Microbiol Infect. 19, E568-E581 (2013).
- Stoneking, L. R., et al. Would earlier microbe identification alter antibiotic therapy in bacteremic emergency department patients. The Journal of emergency medicine. 44, 1-8 (2013).
- Nordmann, P., Dortet, L., Poirel, L. Rapid detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol. 50, 3016-3022 (2012).
