Préparation d'une hémoculture Pellet pour Rapid bactérienne identification et les tests de sensibilité aux antibiotiques
Summary
Une préparation de culot bactérien rapide à partir d'une culture de sang positif peut être utilisé comme échantillon pour des applications telles que l'identification par MALDI-TOF, la coloration de Gram, les tests de sensibilité aux antibiotiques et le test basé sur la PCR. Les résultats peuvent être transmis rapidement aux cliniciens pour améliorer les résultats des patients souffrant d'infections du courant sanguin.
Abstract
Les bactériémies et septicémie sont une cause majeure de morbidité et de mortalité. Le succès des patients atteints de bactériémie dépend de l'identification rapide de l'agent infectieux pour guider le traitement antibiotique optimal. L'analyse de la coloration de Gram de la culture de sang positive peut être réalisée rapidement et déjà d'impact significatif sur le traitement antibiotique. Cependant, l'identification précise de l'agent infectieux est toujours nécessaire pour établir le traitement optimal ciblée. Nous présentons ici une préparation de culot bactérien simple et rapide à partir d'une hémoculture positive qui peut être utilisé comme un échantillon de plusieurs applications essentielles en aval telles que l'identification par MALDI-TOF MS, les tests de sensibilité aux antibiotiques (AST) par méthode de diffusion sur disque ou systèmes AST automatisés et par PCR automatisé à base de tests de diagnostic. La performance de ces systèmes d'identification et AST différentes appliquées directement sur les culots bactériens d'hémoculture est très similar à la performance s'obtient normalement à partir des colonies isolées cultivées sur des plaques d'agar-agar. Par rapport aux approches conventionnelles, l'acquisition rapide d'un culot bactérien réduit considérablement le temps de signaler la fois l'identification et AST. Ainsi, suite à sang positivité de la culture, de l'identification par MALDI-TOF peut être signalée en moins de 1 heure alors que les résultats d'AST par des systèmes AST automatisés ou des essais de diffusion de disque dans les 8 à 18 heures, respectivement. De même, les résultats d'un test rapide basé sur la PCR peuvent être communiqués aux cliniciens moins de 2 heures suivant le rapport d'une bactériémie. Ensemble, ces résultats démontrent que la préparation rapide d'un culot bactérien de la culture du sang a un impact significatif sur le temps d'identification et AST redressement et donc sur le succès de patients souffrant d'infections de la circulation sanguine.
Introduction
Les bactériémies et septicémie chez les patients hospitalisés sont une cause majeure de morbidité et de mortalité. Ainsi, la mortalité liée à la circulation sanguine infections est observée chez environ 14% à 37% des patients hospitalisés et peut augmenter de 35% en unités de soins intensifs des patients 1-3. L'identification rapide de l'agent infectieux est essentiel pour guider le traitement optimal des antimicrobiens et à accroître le succès de la thérapie antimicrobienne 4,5. L'analyse rapide de la coloration de Gram de hémoculture positive a déjà un impact significatif sur l'adaptation de la thérapie antimicrobienne 6,7 mais l'identification précise de l'agent infectieux est nécessaire pour fournir le traitement antibiotique le mieux adapté aux patients. Par exemple, les différents régimes de traitement antibiotique doivent être mis en œuvre suivant une bactériémie avec les entérocoques et les streptocoques qui sont difficiles à distinguer par la coloration de Gram. De même, l'identification à l'espèce Level est nécessaire pour détecter les entérobactéries Gram négatif ampC codant pour un gène chromosomique qui confère une résistance accrue aux β-lactames 8.
Avec une hémoculture positive, l'approche diagnostique classique consiste à repiquer l'agent infectieux sur différentes plaques d'agar, qui nécessite plusieurs heures d'incubation supplémentaire identification préalable avec diverses approches, y compris des tests biochimiques, la croissance sur différents milieux sélectifs et les systèmes d'identification microbienne automatisés. Le temps les résultats d'une approche diagnostique classique est d'environ 1 à 3 jours.
L'émergence de la technologie désorption laser assistée par matrice / ionisation temps de vol spectrométrie de masse (MALDI-TOF) pour l'identification rapide des micro-organismes a fourni un nouvel outil pour identifier rapidement les micro-organismes de colonies cultivées sur des plaques d'agar-agar, mais aussi directement à partir de sang positif cultures (Figure 1) 9-12. Thl'utilisation de l'e de MALDI-TOF d'identifier un agent infectieux à partir d'hémocultures a considérablement réduit le temps aux résultats de quelques minutes au lieu des heures et des jours requis par les méthodes traditionnelles. Comme on le verra par Croxatto et al. 13, l'efficacité de l'identification MALDI-TOF repose sur différents paramètres, y compris la pureté et la quantité du micro-organisme. Ces deux critères sont facilement obtenus à partir des colonies distinctes cultivées sur des plaques d'agar mais nécessaire un traitement pré-analytique pour l'enrichissement bactérienne et purification à partir d'échantillons complexes tels que la culture de sang, qui contiennent plusieurs composants cellulaires et des protéines qui peuvent interférer avec identification MALDI-TOF.
Les méthodes d'isolement de divers micro-organismes de culture de sang ont été utilisés dans un certain nombre d'études, y compris la saponine ou une autre méthode de détergents doux pour l'extraction bactérienne 9,14, méthode de séparation de sérum 10, la lyse des méthodes de centrifugation 12 </shaut> et solutions commercialement tels que le kit de sepsityper. Notre laboratoire de diagnostic bactériologique a mis au point un sang-culture simple préparation de culot bactérien à base de chlorure d'ammonium érythrocytes-lyse qui permettent une identification rapide de bactéries et de levures par MALDI-TOF et des systèmes d'identification automatisés (figure 2) 15. Cette préparation de pastilles hémoculture également fournir un échantillon pour d'autres applications directes en aval tels que la coloration de Gram, tests de diagnostic basés sur la PCR automatisées telles que POCT-PCR pour la détection rapide de résistant à la méthicilline Staphylococcus aureus (SARM) et les tests de sensibilité aux antibiotiques des Les systèmes automatisés d'AST et / ou par des essais de diffusion de disque sur plaques d'agar-agar (figure 3).
Dans ce travail, nous décrivons les différentes étapes de la préparation du culot bactérien sang-culture, comme expliqué par Prod'hom et al. 15 (figure 4). Nous allons également déscribe les protocoles pour trois des principales applications qui peuvent être exécutées sur le culot de la culture de sang: Identification par MALDI-TOF 15, l'identification (ID) et les tests de sensibilité aux antibiotiques (AST) avec les systèmes automatisés 16 pour les entérobactéries et les staphylocoques et PCR automatisé test diagnostique pour la détection du SARM 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Par rapport aux approches diagnostiques d'hémoculture positifs classiques, l'acquisition rapide d'un culot bactérien en utilisant le chlorure lyse approche de centrifugation d'ammonium réduire le temps de signaler l'identification de 16 à 24 heures et le temps de signaler AST de 24 à 48 h (figures 1 et 3).
Introduction rapide d'une antibiothérapie appropriée est essentielle pour améliorer les résultats des patients souffrant d'infections …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les techniciens du laboratoire de bactériologie du CHU de Lausanne pour leur aide à la mise en œuvre des techniques de laboratoire.
Materials
| 20 needle gauge | Terumo, Leuven, Belgium | NN-2038R | |
| 50 ml Falcon tube | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 352070 | 50 ml centrifuge tubes |
| Ammonium chlorure | Merck, Darmstadt, Germany | 101145 | |
| Potassium hydrogen carbonate | Fluka, St. Louis, MO, USA | 60340 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F0507 | Flammable, corrosive |
| a-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Fluka, St. Louis, MO, USA | 70990 | Acute toxicity |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 271004 | Flammable, acute toxicity |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T6508 | Corrosive, acute toxicity |
| Vitek 2 60 instrument | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 27202 | automated microbial system instrument |
| Vitek 2 Gram-positive (GP) card | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 21342 | automated GP identification card |
| Vitek 2 AST-P580 card | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 22233 | automated microbial AST system |
| Vitek 2 Gram-negative (GN) card | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 21341 | automated GN identification card |
| Vitek 2 AST-N242 card | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 413391 | automated microbial AST system |
| Xpert MRSA | Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA | GXMRSA-100N-10 | nucleic acid amplification technology MRSA |
| GeneXpert IV instrument | Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA | GXIV-4-D | nucleic acid amplification technology instrument |
| Microflex LT MALDI-TOF MS instrument | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | BDAL microflex LT/SH | |
| MSP 96 target steel BC | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 280799 | MALDI target plate |
| Densitometer Densicheck instrument | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 27208 | |
| MALDI Sepsityper kit 50 | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 8270170 | |
| Mac Conkey agar | Biolife, Milano, Italy | 4016702 | |
| Mueller-Hinton agar | Oxoid, Hampshire, England | CM0337 | Mueller-Hinton agar (MH) |
| MHF agar | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 43901 | Mueller-Hinton agar-fastidious organisms agar (MHF) |
| BD columbia III agar | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 254071 | blood agar |
| BD chocolate agar | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 254089 | chocolate agar |
| BD schaedler agar | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 254084 | Schaedler agar |
Riferimenti
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